ScatterJ下载链接：http://download.savannah.gnu.org/releases/scatterj/。

下载解压后，将ScatterJ_.class文件移动到ImageJ安装目录的Plugins文件夹中，重启ImageJ即可在Plugins下拉菜单中找到ScatterJ。下图为ScatterJ的基本操作界面：

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荧光共定位分析

1. 文献中出现最多的共定位分析方法

下图是SCI文献中出现最多也是最基本的荧光共定位分析方法：

我们可以使用ImageJ的Plot Profile工具实现上述分析。

步骤：

（1）File -＞ Open打开需要分析的荧光图片

（2）对于RGB图片，可通过Image -＞ Color -＞ Split channels将各通道分开。如果在拍摄时涉及红绿蓝以外的通道，推荐将各通道分开保存。因为无论图像原本有多少通道，ImageJ也只能拆分出红绿蓝三通道。

（3）Image -＞ Stacks -＞ Images to stack，将多幅图像变成图像栈。

（4）选择工具栏中的直线工具（Line）或矩形工具（Rectangluar），选定图像栈中感兴趣的区域，Analyze＞Plot profile，弹出的图像中，横轴代表线上各像素点，纵轴为各点对应的灰度值；因此图像代表了灰度的变化趋势。点击live使结果图与图像栈中的图像相对应。对比各通道结果图可以大致了解共定位情况，根据需要可以将数据导出Excel重新绘图。

（5）通过Plot Profile分析的一个好处是可以直观地看到图像拍摄的曝光情况。当图像过曝时，灰度值的峰会超过最大值灰度值255，导致图像顶端变成平的。过曝会导致原本可能存在差异的灰度信息丢失。如果离最大灰度值较远说明曝光过浅，过浅也可能导致信息的丢失。

Plot Profile进行共定位分析的缺点是不能对共定位进行定量描述，因此需要进行进一步的定量分析。

2. 荧光共定位定量分析方法

（1）Colocalization Finder插件分析共定位

下载链接：https://imagej.nih.gov/ij/plugins/colocalization-finder.html，安装方法与ScatterJ相同。

步骤：

（1.1）打开待分析图片：

（1.2）Image -＞ Color -＞ Split channels拆分荧光通道：

（1.3）Plugins -＞ Colocalization Finder分析红绿通道共定位情况：

得到共定位散点图，散点图越接对角线共定位程度越高：

散点图颜色的深浅代表其出现的频率，Plugins -＞ 3D -＞ Interactive 3D Surface Plot可以直观的显示：

而双尾分叉形状的散点图共定位效果差：

除散点图外Colocalization Finder还可以得到定量数据：

定量数据解释如下：

这么多定量数据我们该如何选择？

Pearson’s相关系数（PCC），两通道之间的强度分布关系；

Manders重叠系数（MOC），共定位的真实程度；

重叠系数k1和k2，共定位系数m1和m2，共定位系数M1和M2，每个特定抗原对于共定位区域的贡献度。

多数情况下，PCC提供了清晰与适合的结果。

如果一种染色强度大于另一种，MOC的共定位系数更加可靠。

（2）如何计算共定位像素

荧光共定位的百分比也是常见的定量共定位分析方法：

下图最右侧白色为共定位像素：

分析步骤：

ImageJ打开荧光图片，Plugin -＞ Colocalization Finder分析红绿通道共定位情况。在Tumor_cells红色荧光通道上显示共定位像素，会在Image3上显示为绿色：

绿色显示的即为共定位像素：

Image -> Type将共定位像素图片由RGB转换为HSB Stack图片，饱和度（Saturation）图片对应共定位像素，Image ->Adjust Threshold选中共定位像素后续测量面积即可。

（3）有关3D共定位分析

方法为打开层扫荧光图片在ImageJ主菜单上点击Image -> Stacks -> Orthogonal views，即可显示XY,XZ,YZ视图，XY视图中的黄色十字可以用鼠标拖动。

（4）ScatterJ共定位分析

（4.1）ScatterJ绘制共定位散点图

共定位散点图可以直观和定量地描述共定位程度。在ScatterJ中可以方便地实现散点图地绘制。

步骤：

（4.1.1）图像导入：ScatterJ要求被导入的图像必须为相同尺寸的8位灰度格式图片，且各图间的像素点应是严格对应的。如有必要图像导入前可进行去背景处理。对于叠加后的多通道图像，我们可以直接通过图像拆分（Image ＞ Color ＞ Split channels）得到符合导入要求的一组图像。

（4.1.2）绘制散点图：Plugins ＞ ScatterJ ＞Create scatterplot＞stack1和2中选择需要分析的通道：

散点图的横轴和纵轴分别带别每个像素点在各通道得到的灰度值，因此图像越接近对角线，表示共定位程度越高。

（4.1.3）点击Axes，在Define axes中可自定义坐标轴、命名坐标轴标题等。calibration factor x（y）校准系数可以将每个轴8位灰度值转换成有意义的单位。从而使用有意义的单位而不是使用灰度值进行分析。对于免疫组化图像，如果需要根据光密度值换算成分浓度，即可通过此功能实现。

Colour scale＞Define colours可根据自己的需要改变散点图颜色分布，使图像更加美观。

（4.1.4）回归分析

ScatterJ提供了三种不同的回归方法，包括最小二乘（ordinary least squares）、长轴回归法（major axis，MA）和简化长轴回归法（reduced major axis regression）

勾选Pearson’s coefficient可在结果中显示Pearson相关系数。Pearson可以定量表述两个连续变量间线性关系的密切程度和相关方向。其数值介于-1到1，取值越接近0，变量间相关性越低；取值接近1或-1，则相关性越强。正负号代表相关的方向，为正相关或者负相关。

输出的结果包括计算出的回归线和Pearson相关系数。

除了将回归线绘制到散点图中外，对于MA回归，ScatterJ还允许计算和绘制假设的双变量正态分布的短轴(即垂直于MA的轴)和95%置信椭圆。

（4.2）Backmapping工具

Backmapping工具可根据散点图中的点回溯到输入图像中对应的像素点。如果对共定位散点图中某个区域感兴趣，如散点图中标出的分叉的部分，可通过ROI工具对其进行选择，点击backmapping进行回溯，即可在原始输入图片中显示对应像素点。

为了方便分析，可通过Image＞colour＞merge channels将结果图与单通道图像叠加，由于荧光图是伪彩图，我们可以根据需要选择通道的颜色，使得叠加后的图像更加美观和易于观察。

（4.3）Deviation map工具

Deviation maps工具会计算每一个像素点在散点图中与参考线的距离，并以不同的颜色标注出来。这里的参考线可以是计算得到的相关性回归线，也可以是用户自定义的。可根据不同的需要选择计算水平距离、垂直距离、水平和垂直距离的几何平均数或者角度距离（数据点和参考线的位置向量包围的角度）。

如果以计算得到的回归线为参考线，可以先点击Statistics完成数据分析，再进入Deviation map，系统会自动将回归线相关数据输入Deviation map菜单中。

在许多情况下，尽管共定位散点图总体呈线性趋势，但点群仍会存在一定程度的扩散。通过Deviation maps工具生成的偏差图，我们可以分析这样的扩散是由实际的差异造成的，还是仅仅由统计差异造成。

如图，偏差图中随机分布的颜色表示纯粹的统计学差异。白色为背景。

如果出现某一颜色的集中富集，说明像素群的扩散是由样本中的成分变化造成的，如图中红色区域。这样的信息在原始图像中是很难发现的。

ScatterJ在一个插件中整合了散点图绘制、图像优化、Backmapping工具和Deviation map工具等许多功能，不但非常方便，还有助于挖掘原始共定位图像中难以发现的信息，非常适合荧光共定位图片的定量分析。

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其他共定位分析工具

1. JACoP插件

下载链接：https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html。

2. Coloc 2插件

Coloc 2集成了以往共定位分析的插件的诸多功能，下载及详尽说明如下：https://imagej.net/Coloc_2。

步骤：

(1) 打开待分析图片：

(2) Image -＞ Color -＞ Split channels拆分荧光通道：

(3) Analyze -＞ Colocalization -＞ Coloc 2，选好待分析Channel，算法都勾选上，点击OK。

得到两通道共定位散点图：

皮尔森系数等结果：

需要提醒大家注意的是上图结果中Threshold是指对图片的灰度设定一个阈值，高于多少才能被计算，目的是降低背景。如果图片中物体与背景区分明显，可以很好进行Threshold，建议用above threshold的值。

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