链霉菌实验操作1 |
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链霉菌实验操作1
录入时间:2009-8-28 16:09:31 来源：食品科技网 一、培养基、抗生素、生长因子 常用抗生素及其使用浓度 抗生素 英文名称及缩写 抗性基因 贮藏液浓度(mg/ml) 使用终浓度（μg/ml） 链霉菌 大肠杆菌 MM 2CM YEME LA或LB 氨苄青霉素 氯霉素 潮霉素 卡那霉素 壮观霉素 链霉素 硫链丝菌素 红霉素 阿泊拉霉素 Ampicillin, Amp Chloramphenicol, Cml Hygromycin, Hyg Kanamycin, Km Spectinomycin, Spc Streptomycin, Str Thiostrepton, Thio Erythomycin, Ery Apramycin, Am bla cat hyg aac或aph aadA str tsr ermE aac(3)IV 100 25(无水乙醇配) 50 25 50 50 25(DMSO配) 100 50 R 10 10 2? 50 10 5 100 10 R － 25 50 50 25 10 － 50 R － － － 50 － 2.5 － 50 50-100 25 50 50 50 25 不敏感 20 30-50 *– 表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制 *此表仅供参考！！！ *R表示不敏感 *Km 和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。 *Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。 *有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, Vio LB（Luria-Bertani）培养基 胰蛋白胨 10g， 酵母抽提物 5g， NaCl 5g，葡萄糖 1g， 蒸馏水加至 1000ml， pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次） LA LB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。 ＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖 基本培养基（MM） 溶液：L-天冬酰胺 0.5g， K2HPO4 0.5g, MgSO4·7H2O 0.2g, FeSO4·7H2O 0.01g, 蒸馏水至 1000ml 将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。 配置MM的琼脂有lab agar、Ice agar(IA) R5（1L）链霉菌原生质体转化时用 蔗糖 103g K2SO4 0.25g MgCl2·6H2O 10.12g 葡萄糖 10g Difco酪蛋白氨基酸 0.1g 微量元素溶液 2ml Oxoid酵母提取物 5g TES 5.73g 加蒸馏水至 1000ml 称取5.5g Difco琼脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅灭菌（114度15分种）。使用时，将培养基融化，每瓶中加入： KH2PO4(0.5%) 2.5ml CaCl2·2H2O(5M) 1ml L-脯氨酸(20%) 3.75ml NaOH(1M)调pH至7.3 对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考《手册》） YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L（液体培养链霉菌） Oxoid酵母提取物 3g Oxoid蛋白胨Tryptone 5g 麦芽提取物（BD公司原Difco公司218630） 3g 葡萄糖 10g 蔗糖 ＊ 340g 蒸馏水 至1000ml 高压灭菌后加入：（8磅灭菌，113－114゜C，15min，自动灭菌锅一次不能灭过多东西，否则会灭不彻底。） MgCl2·6H2O(2.5M) 2ml/L 制备原生质体时，还要加入： 甘氨酸（20%） ＊ 25ml/L ＊ 蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。 ＊ 甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使菌丝体片段更短，利于溶菌，有利于外源DNA的导入。 TSBY （1L）（液体培养链霉菌） Oxoid胰胨豆汤粉（TSB） 30g 蔗糖＊ 340g Oxoid酵母抽提物 5g 蒸馏水 至1000ml *不同菌株培养需要不同浓度的蔗糖，蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。 MS培养基 将黄豆饼粉加蒸馏水煮2到3小时，用纱布过滤得到滤液，将每250ml滤液分装到装有5g琼脂，5g 甘露醇的500ml三角瓶中，10磅灭菌，使用时调pH7.2-7.3。 2CMY培养基（用于井岗的接合转移） 可溶性淀粉 10g 胰蛋白胨 2g NaCl 1g (NH4 )2SO4 2g K2 HPO4 1g CaCO3 2g 无机盐溶液* 1 ml 琼脂 20g 蒸镏水 1000 ml PH7.2 无机盐溶液(每升) FeSO4 .7H2 O 1g MgCl.6 H2 O 1g ZnSO4. 7H2 O 1g YMS培养基（阿维，井岗产孢） 酵母抽提物 4g 可溶性淀粉 4g 麦芽糖 10g CoCl. .6 H2 O 5mg 琼脂 20g 蒸镏水 1000 ml PH7.2 YD培养基 酵母抽提物 4g 麦芽糖 10g 葡萄糖 4g MgCl 2g CaCl 1.5g 琼脂 15g 蒸镏水 1000 ml PH7.2 生长因子补充物的使用浓度 天蓝色链霉菌1258 、J1501等都是营养缺陷型菌株，培养这些菌株时一般需向培养基中补加营养因子，使用浓度如表 生长因子补充物的使用浓度表 化合物 储存液（mg/ml）1 终作用浓度（μg/ml） 组氨酸（Histidine） 10 50 其它氨基酸2 7.5 37 腺嘌呤，鸟嘌呤， 胸腺嘧啶，尿嘧啶 1.5 7.5 维生素 0.1 0.5 1. 储存液用无菌去离子水配置，8磅灭菌后4oC保存。 2. 对于半胱氨酸营养缺陷型菌株，补充光氨酸。
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