1、试剂准备

酸酒精：在100mL 70%乙醇中加入1mL 盐酸，室温保存。

注意：冰冻切片后，各种步骤（干燥，乙醇或甲醇固定，热固定，使用带电的或有粘性的盖片）保证组织切片在染色过程中不脱落。

2、95%乙醇：在HE染色开始前，组织切片需要固定并水化。将切片置于95%乙醇中约2min，开始水化并固定组织。

注意：跳过使用95%乙醇对组织进行水化和固定，并不影响形态学上的细节。

3、水化：进一步对组织切片进行水化3~5min，并冲掉前一步残留的乙醇。

注意：与第一步相似，跳过水化对于组织染色的质量非常小。

4、苏木素：水化后，组织切片用苏木素染色1~3min，可根据染色结果和要求调整染色时间。苏木素是一种基本染料，可以对细胞的酸性成分进行染色，包括核酸、粘多糖、酸性糖蛋白，将他们染成蓝-紫色。

注意：没有苏木素，伊红会将组织染成亮粉红色；显而易见的是缺乏细胞核。组织结构很难区分，细胞内成分几乎都不存在，难以辨别。而上述问题，可以通过使用苏木素进行复染。

染色较弱是由于：

（1）自身溶解或者固定不好；

（2）过度脱钙；

（3）染色时间不足；

（4）过度脱色--- 酸与醇的比例过高或者酸乙醇脱色时间过长；

（5）苏木素的作用较弱：苏木素氧化过度（过老）或水稀释过度；

（6）漂洗溶液的污染；

（7）切片过薄；

（8）乙醇的去除或者染色前水的漂洗不充分。

染色过度是由于：

（1）组织切片干燥；

（2）苏木素浓度过高；

（3）染色时间过长；

（4）载玻片粘合剂过多；

（5）脱色：过弱或时间不足；

（6）切片过厚；

（7）热暴露的时间过长。

5、水洗：苏木素染色后，用水洗组织是非常重要的。这一步以及随后的水洗，可将多余的染料，媒染剂等去除。适当的漂洗可以去除表面金属光泽，金属光泽可阻止苏木素的染色。

注意：跳过此步，将产生不好的结果，例如沉淀的形成，染液的稀释，表面金属光泽的存在。

6、酸酒精：酸酒精分色剂3~5sec。在苏木素染色方法中，组织切片有意过度染色，酸酒精将去除多余的染料以及玻片上的背景染色。

注意：如果没有此步骤，组织切片将变为暗紫色。嗜酸结构，例如，胶原，将不会呈现明亮

的粉红色。组织结构之间将很难区分。很难对切片做出正确的判断。分色过度可能是由于：

（1）酸浓度过高；

（2）脱色时间过长等。

分色不足是由于：

（1）酸浓度过低；

（2）脱色时间不足；

（3）在切片上有多余的蛋白或者明胶等。

7、水洗：水洗30sec，终止酸酒精反应，进一步阻止酸酒精从组织切片上将大量苏木素去除。

注意：如果切片没有经过漂洗，酸酒精可以过度脱色。如果不去除脱色剂，酸酒精将持续从组织切片上去除苏木素。

8、自来水冲洗或用蓝化液蓝化：自来水冲洗3~5min，可起到发蓝处理，将紫红色的苏木素转变为蓝紫色。通常，发蓝试剂是pH依赖性的，由碱性溶液构成。因此，如果自来水作为发蓝试剂，pH值的每天监控是非常重要的，因为自来水的pH值可能每天都会波动。

或用蓝化液蓝化，30sec~1min；流动的自来水冲洗5min；

注意：跳过发蓝试剂步骤，将会导致苏木素染液的颜色发生微妙的变化，难以区分。代替深蓝色，细胞核将呈现紫色，有时甚至是红色。细胞核不可过度蓝染。如果组织染色过蓝，一般是在组织切片上苏木素过多所致。

9、水洗：为伊红复染做准备，通过水洗30sec，将多余的发蓝试剂去除。因为在碱性环境下，伊红无法染色，水洗去除发蓝试剂将允许伊红保持其酸性pH值，使伊红得以均匀复染。

注意：发蓝试剂之后，如果没有水洗，组织切片无法正确使用伊红染色。因此，酸性结构将被染为苍白色并且不均匀，进而导致错误的判断。

10、伊红：为了正确区分胞内结构，伊红是出色的苏木素复染剂。伊红复染30~60sec，可根据染色结果和要求调整染色时间。伊红是酸性染料，可染细胞质，尤其是线粒体、分泌颗粒和胶原。它可以区分细胞内不同的细胞器以及不同的结缔组织。

注意：使用伊红复染组织切片的失败，将导致组织切片的低分化。

染色较弱是由于：

（1）组织切片过薄；

（2）染色时间不足；

（3）随后95%酒精分化过度。

染色过度是由于：

（1）染液浓度较高（可能是由于过度蒸发）；

（2）组织切片过厚；

（3）染色时间过长；

（4）随后95%酒精分化不足。

伊红染色未分化（一种颜色）是由于：

（1）固定不彻底；

（2）过度染色（染色时间过长；染液浓度过高）

11、95%乙醇：95%乙醇处理2 s~1 min，根据染色结果和要求调整；伊红分化将产生不同的粉色。

注意：如果95%乙醇被稀释（例如，从前一步染色中携带了伊红），分化的效果较差。

12、100%乙醇：通过100%乙醇使组织切片脱色。100%乙醇处理1 min；再用新的100%乙醇处理1 min。

注意：这一步很难引起注意，若无95%乙醇，难以区分酸性结构，组织切片成为粉色。若无100%乙醇脱水，组织切片不能完全脱水，导致在盖片下形成水珠。这些水珠可与下一步的二甲苯结合而形成白色混浊物，这将影响组织切片的质量。

13、二甲苯：二甲苯处理5min。在充分脱水后，二甲苯可将组织切片上的酒精去除。去除酒精后，在载玻片上加盖玻片时，二甲苯也可作为包埋剂确保可溶解。由于有潜在的毒性，二甲苯替代品，例如柠檬烯、环烷烃也可使用。替代品可提供相同的组织染色质量，并且他们使用更安全，操作更简单。

注意：当跳过此步骤时，不使用二甲苯透明，酒精将会保存于组织切片上，导致伊红从切片上流出。

14、封片：中性树胶封片，自然风干或烤干，显微镜观察。

染色结果：

细胞核染为蓝色；细胞质染为红色。