1.本发明属于生物医药材料领域，涉及一种负载单原子铜催化剂（sa-cu-mxene）的人工骨材料及应用。

背景技术：

2.骨肉瘤(osteosarcoma, os)是一种常见的原发性恶性肿瘤，好发于青少年，恶性程度高，具有很高的致残率及致死率，目前临床上针对骨肉瘤的主要治疗方法是采取外科手术切除及新辅助化疗的综合治疗，然而手术切除骨肉瘤除了会造成巨大的肿瘤性骨缺损，残存的骨肉瘤细胞还会导致肿瘤复发。目前应用于骨缺损中的骨修复材料种类很多，大致可分为传统骨修复材料与现代骨修复材料。传统骨修复材料容易获得，制作的难度与成本相对较低，其中自体骨是骨缺损修复材料中的金标准，但骨量有限、取骨的并发症等限制了自体骨应用。同种异体骨与自体骨相比来源广泛，形态不受限制，经过深冻和处理后，可以作为自体骨的可靠替代品，但是它的免疫原性会影响细胞黏附和分化，此外还有传染疾病、延迟愈合和感染等风险。而现代骨修复材料的研究技术更加微观，随着纳米技术、基因工程、复合材料的进步，可以使其取得更加仿生化的结构，提高骨再生与骨修复的能力，但是研究成果尚未成熟，临床的安全性与经济成本仍待考核。但是复合材料的出现，打破了传统骨修复材料与人工骨修复材料间的界限，单纯的骨修复材料难免有其局限性，复合骨修复材料以提升骨生物特性与骨修复能力逐渐成为主流。3.当前，骨修复材料主要包括以下几类：无机生物材料，如生物玻璃或生物陶瓷；天然高分子材料；人工高分子材料；及金属材料等。其中天然高分子材料的主要有胶原蛋白、纤维蛋白、弹力蛋白、藻酸盐、透明质酸和异种衍生材料等，其显示出更好的对细胞的亲和作用，但由于其存有量少，可加工性差和提纯困难等缺点，使其应用较少18.。相较于天然高分子材料，人工生物高分子材料的性能更优异，现运用较多的人工有机高分子材料，主要有聚乳酸-乙醇酸（plga）、左旋聚乳酸（plla）、聚乙醇酸（pga）等，由于其有可调控的降解性，可加工性和优良的韧性19.，在组织工程领域具有较强的优势，但其疏水性和弱的生物活性可能不利于材料与骨整合。在无机生物材料用于骨缺损的修复这一观点，最早是由hench教授团队在1971年提出的，他们发现含有na2o-cao-sio2-p2o5（45s5）组分的生物活性玻璃（bg）能诱导磷灰石在其表面的沉积，并与宿主骨组织整合形成牢固的界面21.。随后，各种组分和含量的生物活性玻璃被开发出来，用于骨缺损的修复。并发现，玻璃的组分对其成骨活性有重要影响，其溶解过程中释放出来的ca、p和si能够促进成骨细胞的增殖和分化22.。虽然生物活性玻璃具有成骨活性，但其固有的脆性和与天然骨组织不匹配的机械性能限制了其在临床上的应用。4.然而，拥有了性能良好的骨修复材料，但是其缺乏抗肿瘤性能，难以抑制局部残留的肿瘤细胞增殖，导致临床治疗效果受限，因此肿瘤性骨缺损的修复至今仍是临床治疗所面临的重大难题，鉴于此，目前亟需研发兼具抗肿瘤及促成骨功能的人工骨。以满足临床对肿瘤性骨缺损修复材料的需求。人们探索很多基于新型生物材料辅助或替代传统抗肿瘤的治疗方法，其中光热治疗（ptt）是利用近红外激光照射肿瘤部位，使光热试剂在近红外光的作用下产生光热效应，将光能转换成热能，这会导致肿瘤部位形成局部高温，进而诱导肿瘤细胞死亡。但由于ptt的局部高温（50℃以上）在杀死肿瘤细胞同时也会通过热扩散对病灶周围的正常组织造成热损伤，为了避免这个问题，研究者们开始使用温和ptt（45℃）去诱导肿瘤细胞死亡。然而，由于肿瘤细胞能激活其自我保护路径，如热休克蛋白（hsps），以快速修复低热造成的细胞损害，促使低温ptt的治疗效果往往不够理想。

技术实现要素：

5.本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种负载单原子铜催化剂（sa-cu-mxene（ti3c2clx）)的人工骨及其制备方法。6.为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：所述负载单原子铜催化剂的人工骨材料由左旋聚乳酸粉末（plla）、生物活性玻璃粉末（bg）、sa-cu-mxene粉末组成；在负载单原子铜催化剂的人工骨材料中，所述左旋聚乳酸粉末、生物活性玻璃粉末、sa-cu-mxene粉末的质量百分比含量分别为89.25～89.75%、10.0%、0.25～0.75%。7.优选地，在负载单原子铜催化剂的人工骨材料中，所述左旋聚乳酸粉末、生物活性玻璃粉末、sa-cu-mxene粉末的质量百分比含量分别为89.5%、10%、0.5%。8.优选地，所述左旋聚乳酸粉末的分子质量为150000，特性粘度 2.5~3.0 dl/g ，纯度＞99%，熔点为170℃。9.优选地，所述生物活性玻璃粉末由cao、sio2、p2o5和na2o组成；所述生物活性玻璃粉末中cao、sio2、p2o5和na2o的质量百分比含量分别为24.5%、45%、6%和24.5%；所述生物活性玻璃粉末的粒径为0~20μm，中位径＜5μm，纯度＞99%。10.优选地，所述sa-cu-mxene粉末纯度大于99%，粒径1-5微米，铜以单原子形式负载在mxene（ti3c2clx）上。11.基于上述负载单原子铜催化剂的人工骨材料制备人工骨的方法是先利用计算机辅助设计软件设计出具有多孔结构和个体化外形的三维模型；然后将左旋聚乳酸粉末、生物活性玻璃粉末与sa-cu-mxene粉末在无水乙醇溶液中利用磁力搅拌和超声分散技术混合均匀；再将混合溶液经过滤、干燥后并保温制得人工骨材料；最后将人工骨材料通过激光快速成形技术制备出多孔人工骨支架。12.优选地，所述磁力搅拌时间为10～30min，磁力搅拌速度为100～500r/min，超声分散时间为5～10min，超声分散温度为50～60℃。13.优选地，所述干燥温度为50～60℃，保温时间为12～24h。14.优选地，所述激光快速成形中，激光功率为2.4～2.5w，扫描速度为70～80mm/min，扫描间距为0.8～1.0mm，光斑直径为0.5～0.8mm，粉床预热温度为180～200℃。15.具体总结来说，本发明所述负载单原子铜催化剂的人工骨材料制备人工骨的方法包括如下步骤：（1）根据不同患者的需要，应用计算机辅助设计（pre/engineer、solidworks等）三维制图软件，进行cad三维实体绘图；（2）称量一定量的plla粉末，将plla粉末加入装有无水乙醇的烧杯中，溶液经磁力搅拌和超声分散技术混合均匀，主要工艺参数为：磁力搅拌时间为10～20min，磁力搅拌速度为100～500r/min，超声分散时间为20～30min，超声分散温度为50～60℃。16.（3）称量一定量的bg粉末，再将bg粉末加入上述装有plla溶液的烧杯中，混合溶液经磁力搅拌和超声分散技术混合均匀；（4）称量一定量的sa-cu-mxene粉末，将sa-cu-mxene粉末加入另外一个装有无水乙醇的烧杯中，溶液经磁力搅拌和超声分散技术混合均匀；（5）将sa-cu-mxene溶液倒入装有plla和bg溶液的烧杯中，溶液再经磁力搅拌和超声分散技术混合均匀；（6）混合溶液过滤后，在电热鼓风干燥箱中干燥，主要工艺参数为：干燥温度为50～60℃，保温时间为12～24h；（7）将混合粉末置于激光快速成形系统中，根据三维模型进行层层烧结，烧结完成后，利用压缩空气去除未烧结的粉末，形成所需人工骨的三维实体，主要工艺参数为：激光功率为2.4～2.5w，扫描速度为70～80mm/min，扫描间距为0.8～1.0mm，光斑直径为0.5～0.8mm，粉床预热温度为180～200℃。17.上述负载单原子铜催化剂的人工骨材料可用于制备治疗骨肿瘤术后抑制肿瘤复发及转移人工骨，还可以用于制备骨修复增强性人工骨。18.下面对本发明作进一步说明：本发明将单原子铜催化剂（sa-cu-mxene)与骨修复材料复合，sa-cu-mxene是一种优异的光热材料，具备光热转换效率高、低毒性以及生物相容性优良的优点，同时作为单原子纳米酶的一种，集成了单原子技术和固有的类酶活性位点，将纳米酶技术提升到原子水平，并为突破其固有的局限性提供了新的机遇，并且其原子分散的金属中心最大限度地提高了原子利用效率和活性位点密度，具有比传统纳米酶高10-100倍的优异催化活性。据此，sa-cu-mxene可100%利用cu原子催化中心，其具有卓越的过氧化物酶（pod）和谷胱甘肽氧化酶（gshox）活性，既可以使gsh的耗竭，及进一步促使谷胱甘肽过氧化物酶４（gpx4）失活和脂质过氧化物（lpo）上调，同时又可以高效的催化h2o2，造成细胞内活性氧（ros）的积累，因此导致肿瘤细胞发生铁死亡。同时，sa-cu-mxene在铁死亡过程中产生的大量的lpo和ros可有效消除因热应激而上调的自我保护性hsps。综合以上机理，sa-cu-mxene在808nm近红外光诱发下既能发挥温和ptt抗肿瘤作用，又能诱发肿瘤细胞发生铁死亡，在两者协同作用下使抗肿瘤效应倍增。19.本发明将生物活性玻璃（bg）与人工有机高分子材料（plla）复合来制备人工骨材料，是骨修复材料中的创新及突破，它们可以克服各自的局限性，同时也可模拟天然骨组织的有机-无机复合结构用于骨修复，其具有可调控的降解性、力学性能及良好的生物活性和生物活性。20.本发明将plla、bg、sa-cu-mxene三种材料复合，采用选择性激光烧结技术（sls），在加工生物聚合物材料方面具有无可比拟的巨大优势，它可以满足人工骨复杂的外形和多孔贯通的内部结构的要求，主要通过三维模型的设计和激光扫描参数的优化，来实现骨支架的定制化外形以及多孔结构，能够保证孔径的大小、分布以及数量，更重要的是能做到孔隙之间的完全贯通，能够根据不同的情况，快速制备出相应所需的多孔骨材料。同时该材料在红外激光外场驱动下具备可调控的抗肿瘤性能，及优异的力学性能和良好的生物活性，运用增材制造技术可实现完美的人工骨植入，是目前作为修复肿瘤性骨缺损的优异材料。21.本发明具体抗肿瘤机理：在中性和弱酸性环境中，一价铜离子催化的类芬顿（fenton）反应效率很高，比二价铁离子催化的反应速度快约160倍。本发明中单原子铜催化剂（sa-cu-mxene）分离出的二价铜离子率先被肿瘤微环境中谷胱甘肽（gsh）特异性地结合，还原为一价铜离子，然而使gsh的大量耗竭，及进一步促使谷胱甘肽过氧化物酶４（gpx4）失活，而被还原成一价铜离子即可高效的催化h2o2发生类芬顿反应，产生大量的游离羟基（·oh），从而造成细胞内活性氧（ros）和脂质过氧化物（lpo）的积累，因此导致肿瘤细胞发生铁死亡。同时，sa-cu-mxene在铁死亡过程中产生的大量的lpo和ros可有效消除因热应激而上调的自我保护性hsps。综合以上机理，sa-cu-mxene在808nm近红外光诱发下既能发挥温和ptt抗肿瘤作用，又能诱发肿瘤细胞发生铁死亡，在两者协同作用下使抗肿瘤效应倍增。22.本发明所述的负载单原子铜催化剂的人工骨材料具有如下优势：（1）单原子铜催化剂（sa-cu-mxene）是一种单原子纳米酶，集成了单原子技术和固有的类酶活性位点，将纳米酶技术提升到原子水平，其原子分散的金属中心最大限度地提高了原子利用效率和活性位点密度，具有比传统纳米酶高10-100倍的优异催化活性。在sa-cu-mxene中可100%利用cu原子催化中心，并因其高度不饱和配位性质，使大大提高材料的利用率及反应速率。23.（2）相对传统的金属纳米材料，sa-cu-mxene游离金属含量极少，从而避免了大量金属离子对正常细胞的毒害.（3）其载体材料mxene是一种优异的光热材料，具备光热转换效率高、低毒性以及生物相容性优良的优点，并有促进骨再生的作用。24.与现有技术相比，本发明的有益效果为：（1）采用选择性激光烧结系统制备生物高分子人工骨材料，可满足实际应用中对人工骨材料个体化外形和内部多孔结构一体化制造的要求。25.（2）利用有机高分子材料和无机材料复合，以克服各自的运用的局限性，同时也可模拟天然骨组织的有机-无机复合结构用作骨修复，该复合材料具有可调控的降解性、力学性能及良好的生物活性和生物活性，以促进骨髓间充质干细胞的附着、增殖和成骨分化，并能在体内诱导骨再生。26.（3）通过利用人工骨材料中sa-cu-mxene高光热转化率、低毒性的特点，其可将吸收的近红外光转化为低热量来杀死肿瘤细胞及诱发肿瘤细胞铁死亡，实现了体内肿瘤的清除。从而通过此项目的研究，制备的复合骨支架有望为骨肉瘤术后综合治疗提供了一种新选择。27.总之，本发明利用选择性激光烧结技术（sls），集成sa-cu-mxene纳米材料制备一种宏观/微观多重结构仿生、力学适配及组成可控的复合多孔人工骨材料，构建的这种同时兼备骨修复、抗肿瘤人工骨，为骨肉瘤术后综合治疗提供了一种新的选择。附图说明28.图1为复合骨支架大体观及物相结构图；图2为复合骨支架的生物力学性能；图3为复合骨支架的光热性能；图4为复合骨支架的抑瘤性能及活性氧验证图；图5为复合骨支架的矿化实验；图6为复合骨支架的生物相容性；图7为复合骨支架促进 bmscs成骨性能。具体实施方式29.下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，但本发明之内容并不局限于此。30.实施例1（空白对照组）（1）称量5g分子质量为150,000的左旋聚乳酸（plla）粉末，将其分散于50ml无水乙醇溶液中，溶液经磁力搅拌和超声分散混合均匀，其中磁力搅拌时间为10min，磁力搅拌速度为300r/min，超声分散时间为30min，超声分散温度为50℃。31.（2）混合溶液过滤后，在电热鼓风干燥箱中干燥，主要工艺参数为：干燥温度为50℃，保温时间为24h。32.（3）将混合粉末置于激光快速成形系统中，根据三维模型进行层层烧结，烧结完成后，利用压缩空气去除未烧结的粉末，形成所需人工骨的三维实体，主要工艺参数为：激光功率为2.5w，扫描速度为70mm/min，扫描间距为0.8mm，光斑直径为0.5mm。33.（3）复合粉末烧结性能良好，plla骨支架经x射线衍射（xrd）检测分析均能检测到plla特异性波峰存在（如图1）；拉伸性能测试发现人工骨的拉伸强度为7.55mpa，拉伸模量为612 gpa，压缩性能测试发现人工骨的压缩强度为19.22mpa，压缩模量为427.13gpa（如图2）。34.实施例2与实施例1相比，主要区别在于添加生物活性玻璃（bg）粉末，占复合粉末的质量比为10%，具体操作如下：（1）称量4.5g分子质量为150,000的plla粉末，将其分散于50ml无水乙醇溶液中，溶液经磁力搅拌和超声分散混合均匀，其中磁力搅拌时间为10min，磁力搅拌速度为300r/min，超声分散时间为30min，超声分散温度为50℃。35.（2）称量0.5g的bg粉末，再将bg粉末加入上述装有plla溶液的烧杯中，混合溶液经磁力搅拌和超声分散技术混合均匀；（3）混合溶液过滤后，在电热鼓风干燥箱中干燥，主要工艺参数为：干燥温度为50℃，保温时间为24h。36.（4）将混合粉末置于激光快速成形系统中，根据三维模型进行层层烧结，烧结完成后，利用压缩空气去除未烧结的粉末，形成所需人工骨的三维实体，主要工艺参数为：激光功率为2.5w，扫描速度为70mm/min，扫描间距为0.8mm，光斑直径为0.5mm。37.（5）复合粉末烧结性能良好，拉伸性能测试发现人工骨的拉伸强度为9.12mpa，拉伸模量为788mpa，压缩性能测试发现人工骨的压缩强度为25.13mpa，压缩模量为566.321mpa，提示：拉伸及压缩性能较实施例1上升（如图2）；bg/plla骨支架光热性能测试发现近红外光（808w）照射5min，骨支架局部温度几乎未升高，提示：未达到温和光热设定的温度（45℃），光热效应性能不佳（如图3）；cck—8细胞毒性试验显示：该支架在近红外光照射5min后对骨肉瘤细胞系sao2细胞及骨髓间充质干细胞活力无明显影响（如图4、6）。38.实施例3与实施例1相比，主要区别在于添加bg粉末，占复合粉末的质量比为10%，添加单原子铜催化剂（sa-cu-mxene）粉末，占复合粉末的质量比为0.25%，具体操作如下：（1）称量4.4875g分子质量为150,000的plla粉末，将其分散于50ml无水乙醇溶液中，溶液经磁力搅拌和超声分散混合均匀，其中磁力搅拌时间为10min，磁力搅拌速度为300r/min，超声分散时间为30min，超声分散温度为50℃。39.（2）称量0.5g的bg粉末，再将bg粉末加入上述装有plla溶液的烧杯中，混合溶液经磁力搅拌和超声分散技术混合均匀；（3）称量0.0125g粉末，将sa-cu-mxene粉末加入另外一个装有无水乙醇的烧杯中，溶液经磁力搅拌和超声分散技术混合均匀；（4）将sa-cu-mxene溶液倒入装有plla和bg溶液的烧杯中，溶液再经磁力搅拌和超声分散技术混合均匀；（5）混合溶液过滤后，在电热鼓风干燥箱中干燥，主要工艺参数为：干燥温度为50℃，保温时间为24h。40.（6）将混合粉末置于激光快速成形系统中，根据三维模型进行层层烧结，烧结完成后，利用压缩空气去除未烧结的粉末，形成所需人工骨的三维实体，主要工艺参数为：激光功率为2.5w，扫描速度为70mm/min，扫描间距为0.8mm，光斑直径为0.5mm。41.（7）复合粉末烧结性能良好，拉伸性能测试发现人工骨的拉伸强度为11.23mpa，拉伸模量为865mpa，压缩性能测试发现人工骨的压缩强度为28.25mpa，压缩模量为702.39mpa，提示：拉伸及压缩性能较实施例2上升（如图2）；0.25-sa-cu-mxene /bg/plla骨支架光热性能测试发现近红外光（808w）照射5min，骨支架局部温度从28℃上升到41℃，升温13℃，提示：未达到温和光热设定的温度（45℃）（如图3）。42.实施例4与实施例1相比，主要区别在于添加bg粉末，占复合粉末的质量比为10%，添加sa-cu-mxene粉末，占复合粉末的质量比为0.5%，具体操作如下：（1）称量4.475g分子质量为150,000的plla粉末，将其分散于50ml无水乙醇溶液中，溶液经磁力搅拌和超声分散混合均匀，其中磁力搅拌时间为10min，磁力搅拌速度为300r/min，超声分散时间为30min，超声分散温度为50℃。43.（2）称量0.5g的bg粉末，再将bg粉末加入上述装有plla溶液的烧杯中，混合溶液经磁力搅拌和超声分散技术混合均匀；（3）称量0.025g粉末，将sa-cu-mxene粉末加入另外一个装有无水乙醇的烧杯中，溶液经磁力搅拌和超声分散技术混合均匀；（4）将sa-cu-mxene溶液倒入装有plla和bg溶液的烧杯中，溶液再经磁力搅拌和超声分散技术混合均匀；（5）混合溶液过滤后，在电热鼓风干燥箱中干燥，主要工艺参数为：干燥温度为50℃，保温时间为24h。44.（6）将混合粉末置于激光快速成形系统中，根据三维模型进行层层烧结，烧结完成后，利用压缩空气去除未烧结的粉末，形成所需人工骨的三维实体，主要工艺参数为：激光功率为2.5w，扫描速度为70mm/min，扫描间距为0.8mm，光斑直径为0.5mm。45.（7）复合粉末烧结性能良好，sa-cu-mxene/bg/plla骨支架经x射线衍射（xrd）检测分析均能检测到plla、bg、sa-cu-mxene特异性波峰存在（如图1），提示经过激光烧结后复合骨支架中各组分存在；拉伸性能测试发现人工骨的拉伸强度为13.68mpa，拉伸模量为1042mpa，压缩性能测试发现人工骨的压缩强度为32.43mpa，压缩模量为925.37mpa，提示：拉伸及压缩性能较实施例3上升，力学性能最优（如图2）；1.0-sa-cu-mxene/bg/plla骨支架光热性能测试发现近红外光（808w）照射5min，骨支架局部温度从28°上升到45°，升温17℃, 提示：达到温和光热设定的温度（45℃），光热效应性能最优（如图3）；通过细胞分子生物学实验进一步证明：1.0-sa-cu-mxene/bg/plla复合骨支架能分解肿瘤微环境内h2o2产生·oh，本通过cck8、死活细胞染色验证其具备强大的抑瘤性能（如图4）；复合骨支架的矿化实验证明负载1.0-sa-cu-mxene的复合骨支架矿化更为明显（如图5）；负载1.0-sa-cu-mxene复合骨支架在有/无近红外光照射下骨髓间充质干细胞（bmsc）增殖明显（如图6）；负载1.0-sa-cu-mxene复合骨支架与bmscs共培养，显示出明显的促成骨性能（如图7）。46.实施例5与实施例1相比，主要区别在于添加bg粉末，占复合粉末的质量比为10%，添加sa-cu-mxene粉末，占复合粉末的质量比为0.75%，具体操作如下：（1）称量4.4625g分子质量为150,000的plla粉末，将其分散于50ml无水乙醇溶液中，溶液经磁力搅拌和超声分散混合均匀，其中磁力搅拌时间为10min，磁力搅拌速度为300r/min，超声分散时间为30min，超声分散温度为50℃。47.（2）称量0.5g的bg粉末，再将bg粉末加入上述装有plla溶液的烧杯中，混合溶液经磁力搅拌和超声分散技术混合均匀；（3）称量0.0375g粉末，将sa-cu-mxene粉末加入另外一个装有无水乙醇的烧杯中，溶液经磁力搅拌和超声分散技术混合均匀；（4）将sa-cu-mxene溶液倒入装有plla和bg溶液的烧杯中，溶液再经磁力搅拌和超声分散技术混合均匀；（5）混合溶液过滤后，在电热鼓风干燥箱中干燥，主要工艺参数为：干燥温度为50℃，保温时间为24h。48.（6）将混合粉末置于激光快速成形系统中，根据三维模型进行层层烧结，烧结完成后，利用压缩空气去除未烧结的粉末，形成所需人工骨的三维实体，主要工艺参数为：激光功率为2.5w，扫描速度为70mm/min，扫描间距为0.8mm，光斑直径为0.5mm。49.（7）复合粉末烧结性能良好，拉伸性能测试发现人工骨的拉伸强度为12.21mpa，拉伸模量为922mpa，压缩性能测试发现人工骨的压缩强度为30.69mpa，压缩模量为826.92mpa，提示：拉伸及压缩性能较实施例4下降（如图2）；1.5-sa-cu-mxene/bg/plla骨支架光热性能测试发现近红外光（808w）照射5min，骨支架局部温度从28°上升到49°，升温21℃，提示：超过温和光热设定的温度（45℃）（如图3），将损害周围正常细胞。