1.本发明涉及器官的类器官(organ organoid)及/或构成器官的细胞的培养方法。更详细而言，本发明涉及对器官的类器官及/或构成器官的细胞一边灌注培养液一边进行培养的方法。

背景技术：

2.以针对肝脏、肾脏等各种器官的疾病的医药品开发、再生医疗的实现为目标，正在进行使培养细胞自组装而制造出重现各器官的三维结构、血管、胆管、其他脉管的复杂结构的细胞结构体、即器官的类器官为目的的研究开发。作为这样的器官的类器官的发展性细胞结构体，将包含未分化细胞的特定种类的细胞组合进行培养，从而能够制备在发育初期所形成的器官的原基、即器官芽(例如肝脏的器官芽、即肝芽)。这样也被称为“迷你器官”的类器官，与现有的单独培养的器官的细胞等相比，除了可以用作药效或毒性的评价更接近于生物体的评价系统外，也可用于移植手术、血浆蛋白质的产生等，利用价值极高。3.一般而言，各种器官的类器官是通过在培养液(液体培养基)为静止的环境下的培养(静态培养)而制备的，不过，也提出了在灌注培养液的环境下的培养(灌注培养)。例如，在非专利文献1中，记载了：通过对肾脏类器官进行灌注培养，肾小球的血管变得发达等。另外，在非专利文献2中，记载了：使用微流体装置，将生物组织切片(脑组织的视交叉上核(scn))静置于培养液渗透膜上，并控制培养液的灌注速度来将覆盖组织的液体保持在适当的量，从而保持营养供给与呼吸的平衡，同时进行长期培养等。在非专利文献3中，记载通过将肺上皮细胞以气液界面(ali)灌注培养，能够比静态培养更为促进细胞的成长及分化等。需要说明的是，在这样的器官的类器官、组织等的灌注培养中，一般而言，使培养液以一定的速度灌注并形成“层流”，并且以尽可能不对器官的类器官、组织等施加剪切应力的方式进行。4.现有技术文献5.非专利文献6.非专利文献1：homan,k.a.等，flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.nat methods 16,255-262(2019)doi:10.1038/s41592-019-0325-y7.非专利文献2：ota,n.等，a microfluidic platform based on robust gas and liquid exchange for long term culturing of explanted tissues.analytical sciences,oct 2019,vol.358.非专利文献3：long term culturing of explanted tissues.analytical sciences,oct 2019,vol.35

技术实现要素：

9.发明所要解决的问题10.根据现有通常的静态培养，并不容易将通过长时间的培养而成熟的器官的类器官进一步制备成立体器官。例如，可发现如下问题：如果在静态培养中对肝脏类器官进行长时间培养，则难以维持成熟的肝细胞，经过约2周的培养而发生细胞死亡，细胞密度降低，在细胞间产生空隙。11.本发明的课题在于提供一种培养方法，可对器官的类器官进行长时间培养并使其成熟，适用于制备立体器官。12.用于解决问题的方案13.本技术发明人发现：通过间歇地使灌注的培养液(液体培养基)的流量上升，即间歇地使腔室内的培养液的流速上升，对器官的类器官及/或构成器官的细胞施加暂时性的过渡状态的“湍流”，从而能够制备由已成熟的细胞所构成的、更高密度的器官的类器官或立体器官，从而完成了本发明。14.即，本发明为了解决上述课题，提供以下的[1]～[15]。[0015]1.[0016]一种培养方法，是对被固定化在腔室内的器官的类器官及/或构成器官的细胞一边灌注培养液一边进行培养的方法，[0017]其中，上述培养液以在上述腔室内产生湍流的方式被灌注。[0018][2][0019]根据项1所述的培养方法，其中，上述培养液以分别包含在上述腔室内从层流向湍流转移的时间、产生湍流的时间、从湍流向层流转移的时间的方式被灌注。[0020][3][0021]根据项1或2所述的培养方法，其中，上述器官的类器官及/或构成器官的细胞以被包埋于基质中的状态进行了固定化。[0022][4][0023]根据项1～3中任一项所述的培养方法，其中，包埋有上述器官的类器官及/或构成器官的细胞的基质以被悬挂于通气性膜的状态而固定化在腔室内。[0024][5][0025]根据项1～4中任一项所述的培养方法，其中，上述器官的类器官具有脉管结构，及/或上述构成器官的细胞与脉管细胞共存。[0026][6][0027]根据项1～5中任一项所述的培养方法，其中，上述器官的类器官为肝类器官或肾类器官，及/或上述器官为肝脏或肾脏。[0028][6a][0029]根据项1～5中任一项所述的培养方法，其中，上述器官的类器官为肝脏、肾脏、胰脏、甲状腺、甲状旁腺、肺、脑或心脏的类器官。[0030][7][0031]一种立体器官的制造方法，其包括实施项1～6中任一项所述的培养方法的步骤。[0032][8][0033]根据项1～6中任一项所述的培养方法，其中，上述培养液含有药物。[0034][9][0035]根据项8所述的培养方法，其中，上述药物用于治疗伴随缺血的疾病。[0036][9a][0037]根据项8所述的培养方法，其中，上述药物用于治疗缺血性疾病、梗塞〃坏死性疾病或出血性疾病。[0038][9b][0039]根据项8所述的培养方法，其中，上述药物用于评价伴随缺血或出血的副作用涉及的安全性。[0040][10][0041]一种药效评价方法，其包括实施项8或9所述的培养方法的步骤。[0042][10a][0043]一种药物评价方法，其包括实施项8、9、9a或9b所述的培养方法的步骤、及评价上述药物对于上述器官的类器官的有效性及/或安全性的步骤。[0044][11][0045]一种器官的类器官，其是通过项1～6中任一项的培养方法得到的。[0046][12][0047]一种立体器官，其是通过项7所述的制造方法得到的。[0048][13][0049]一种药效评价方法，其包括在项12所述的立体器官的培养基中添加药物的步骤、及评价上述药物对于上述立体器官的药效的步骤。[0050][13a][0051]一种药物评价方法，其包括在项12所述的立体器官的培养基中添加药物的步骤、及评价上述药物对于上述立体器官的有效性及/或安全性的步骤。[0052][14][0053]一种培养系统，其具有：[0054]腔室，可将器官的类器官及/或构成器官的细胞固定化并收容，所述腔室具有用于对上述器官的类器官及/或构成器官的细胞灌注培养液的流入口及流出口；及[0055]用于灌注培养液的灌注机构；[0056]其中，上述灌注机构以使上述培养液在上述腔室内产生湍流的方式进行控制。[0057][15][0058]根据项14所述的系统，其中，上述灌注机构以如下方式进行控制：以分别包含在上述腔室内从层流向湍流转移的时间、产生湍流的时间、从湍流向层流转移的时间的方式灌注上述培养液。[0059]发明效果[0060]通过本发明的培养方法，与以往相比更易于制备成熟细胞以高密度分布的器官的类器官，且更易于由这样的器官的类器官制备比现有更优异的立体器官。另外，在通过本发明的培养方法得到的器官的类器官或立体器官、或者利用该立体器官的人工器官中，或者在移植了该立体器官的再生医疗中，可以认为药物作用的重现性比现有更高，能够在此条件下进行各种药物的有效性、安全性的评价。附图说明[0061]图1为在实施例(1及2共通)中所构建的培养装置(本发明的培养系统)的简图。[0062]图2为示出针对实施例(1及2共通)中的产生湍流的送液条件(20ml/分钟，间歇)、及作为参考例而以非专利文献1为基准的现有的不产生湍流的层流的送液条件(4ml/分钟，连续)各自的、即将送液前(上)及送液中(下)的培养腔室内的液体培养基的图像。液体培养基通过台盼蓝色素染色。在参考例的送液条件下，液体培养基以整齐的线状(即作为层流)由左侧的流入口流入至腔室内。与此相对，在实施例的送液条件下，液体培养基在漩涡化(即作为湍流)的同时流入至腔室内，另外，已流入的液体培养基撞上腔室的壁面而在腔室内整体地产生湍流。[0063]图3为实施例1中的通过灌注培养(本发明的培养方法)得到的类器官(右)及作为对照的比较例1中的通过静态培养得到的类器官(左)各自的光学显微镜图像(侧面及上面)、核染色图像、及免疫染色图像(asgr1、cd31的双重染色图像。在彩色图像中分别以红色及绿色表示。)的荧光图像，以及从荧光图像中的荧光区域面积所算出的asgr1阳性率(平均±标准差，n＝3的平均值)。[0064]图4为实施例2中的包含通过灌注培养(本发明的培养方法)得到的类器官的基质组合物(右)、及作为对照的比较例2中的包含通过静态培养得到的类器官的基质组合物(左)的观察图像。[0065]图5为实施例2中的通过灌注培养(本发明的培养方法)得到的类器官(右)、及作为对照的比较例2中的通过静态培养得到的类器官(左)各自的免疫染色图像(gs、e-钙粘蛋白及dapi的三重染色图像。在彩色图像中分别以红、绿及蓝表示。)。在实施例2的免疫染色图像(右)中，能够确认到属于成熟干细胞标志物的gs及e-钙粘蛋白的表达，而且细胞密度充实；与此相对，在比较例2的免疫染色图像(左)中，则没有确认到这些标志物的表达，且在类器官的特别是中央部分确认到细胞的脱落。具体实施方式[0066]-器官的类器官等的培养方法-[0067]本发明的培养方法是对被固定化在腔室内的器官的类器官及/或构成器官的细胞或者组织(在本说明书中统称为“器官的类器官等”。)一边灌注培养液的一边进行培养的方法，其中，上述培养液以在上述腔室内产生湍流的方式被灌注。[0068]“腔室”是指如下的部位，其被设置在培养容器(细胞培养装置)内，具有可收容作为培养对象的器官的类器官等的尺寸，以及可固定器官的类器官等的结构。一般而言，腔室具有灌注培养液的流入口及流出口，作为宽度及高度比连通流入口及流出口的培养液的流路更大的部位而构成。从流入口所流入的培养液，在与被固定化的器官的类器官等接触后，从流出口流出。常见的细胞的灌注培养用培养容器已有市售，在本发明中，也可使用相同的培养容器。[0069]《湍流·层流》[0070]在本发明中，培养液于腔室内产生“湍流”是指，腔室内的培养液的流动不是统一的，通过目视可确认到在腔室内、特别是在经固定化的器官的类器官等、或包埋有器官的类器官等的基质的周围、或者在流入口、腔室的壁面的附近，于培养液中产生涡流，优选可确认到产生比规定的基准更高的程度(例如每单位时间的频率、大小等)的涡流。另一方面，与后述本发明的一个优选实施方式相关的“层流”是指，在腔室内的培养液的流动大致是统一的，通过目视可确认到在腔室内、特别是在经固定化的器官的类器官等、或包埋有器官的类器官等的基质的周围、或者在流入口、腔室的壁面的附近，只产生比规定基准低的程度的涡流，优选在培养液中完全或几乎不能确认到产生涡流。需要说明的是，在通过将腔室内的培养液的灌注以配管流、明渠流等模型化、能够从代表长度(水力直径，例如在将配管流中垂直于灌注方向的截面视为圆形时的直径)、代表流速、密度及粘性系数等算出雷诺数的情况下，也可将该雷诺数与规定基准(一个例子为2300)比较，如果更大，则判定为湍流，如果更小，则判定为层流。[0071]用来在腔室内使湍流产生的手段没有特别限定，例如可以是：通过将腔室内的培养液的流量(例如通过单位“ml/分钟”等所表示的值)或流速(通过上述流量/腔室的截面积等所算出的值)调至比规定水平更高，使培养液与腔室的壁面较强烈地碰撞，从而使腔室内产生湍流。另外，也可以在腔室内设置使湍流产生的结构(突起等)，培养液与该结构碰撞从而使腔室内产生湍流。[0072]在对被固定化在腔室内的器官的类器官等一边灌注培养液一边进行培养的期间，可以以不改变条件而产生湍流的方式进行培养，也可以以一边改变条件一边产生湍流的方式进行培养。[0073]在本发明的一个优选实施方式中，培养液以分别包含(i)在腔室内从层流向湍流转移的时间、(ii)产生湍流的时间、(iii)从湍流向层流转移的时间的方式进行灌注。在该实施方式中，腔室内的培养液并非一直产生湍流，而是重复下述状态：(i)从层流向湍流转移中途的状态，(ii)产生湍流的状态，(iii)从湍流向层流转移中途的状态，及(iv)产生层流(也可以是静止)的状态。上述状态(i)～(iv)各自的时间并没有特别限定，例如可通过灌注的培养液的流量或流速(以下将这些统称为“流量等”。)而进行调节。即，状态(i)的时间，可通过从产生层流的规定流量等(以下称为“第1流量等”。)上升至产生湍流的规定流量等(以下称为“第2流量等”。)的时间来调节，或者可通过在如后述的可自动变更流量等的泵等送液机构中从第1流量等的设定切换为第2流量等的设定、利用流路内及腔室内的流量随之改变的时间来进行调节。同样地，状态(ii)的时间可通过保持第2流量等的时间来调节，状态(iii)的时间可通过从第2流量等降低为第1流量等的时间来调节，状态(iv)可通过保持第1流量等的时间来调节，或者，通过与各自对应的送液机构的设定等来调节。例如，在某具有腔室的培养容器中，通常可以是将腔室内设定成产生“层流”的一般范围的流量等作为“第1流量等”，将比其更高、并非现有常规范围的流量等作为“第2流量等”。[0074]《器官的类器官等》[0075]“器官的类器官”是人为地创造的类似于器官或组织的组织体(三维结构体)。本发明中的“器官的类器官”为各种器官或组织的类器官的统称，不仅包含作为器官或组织的类器官而处于已成熟的阶段的类器官，还包含在分化的初期阶段被称为“器官芽”、“原基”等的结构体。[0076]需要说明的是，本发明不但可以适用于“器官的类器官”，还可适用于“癌类器官”(例如参照日本特开2018-110575号公报)。即，依据本发明的培养方法，在以“癌类器官”取代“器官的类器官”而固定化在腔室内，并以使腔室内产生湍流的方式灌注培养液来培养该癌类器官的情况下，能够制备癌细胞以比现有更高的密度分布的癌类器官。因此，本说明书的“器官的类器官”能够根据需要而换用为“癌类器官”，也能够换用为作为“器官的类器官”及“癌类器官”的统称的“类器官”。另外，也可使用“癌类器官”来实施本发明的“药物评价方法”。[0077]作为“器官的类器官”，已知有各式各样的种类，例如肝脏、胰脏、肾脏、心脏、肺脏、脾脏、食道、胃、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、生殖腺、脑、脊髓、皮肤、内耳等的类器官(例如参照https://www.nejm.org/doi/pdf/10.1056/nejmra1806175、https://www.nature.com/articles/s41568-018-0007-6、http://www.amsbio.com/brochures/organoid-culture-handbook.pdf)。根据实施本发明的培养方法的目的，可使用各种器官的类器官，例如肝脏、肾脏、胰脏、甲状腺、甲状旁腺、肺、脑、心脏等的类器官等为本发明中优选的器官的类器官等。这些器官的类器官特别是可以用于实施如后述那样的用于缺血性疾病等的治疗的药物的药效评价方法。[0078]各种器官的类器官的制备方法的基本实施方式、例如必要的细胞和培养条件是已知的，本发明的培养方法的实施方式基本上可根据已知的器官的类器官的制备方法而制造。例如，wo2013/047639、wo2015/129822等所记载的、将(a)构成器官的细胞、(b)血管内皮细胞及(c)间充质细胞(优选为间充质干细胞)共培养的方法，在本发明的培养方法中也优选作为用于制备器官的类器官的方法。[0079]本发明中“构成器官的细胞或组织”是指，用于制备器官的类器官而(根据需要与血管内皮细胞、间充质细胞等其他细胞一起)使用的、构成器官的类器官的至少一部分所需要的细胞，或者包含这样的细胞的组织。“构成器官的细胞或组织”可以是不具有器官的类器官那样的结构、特性的处于单纯的细胞聚集体(细胞球)的阶段的细胞或组织，也可以是从个体分离出的细胞、组织(例如，来源于患者的活检样本)。各种“构成器官的细胞或组织”是已知的，可根据器官的类器官的种类来选择细胞。需要说明的是，固定化在腔室内的“构成器官的细胞”可根据需要而换用为“至少包含构成器官的细胞或组织的、用于制备器官的类器官的细胞或组织”。[0080]“构成器官的细胞”中包含：(a1)构成器官·组织的实质细胞、及(a2)构成器官·组织的非实质细胞。另外，(a1)实质细胞及(a2)非实质细胞中分别包含：(m)分化成熟，或达到分化末期，具有作为实质细胞或非实质细胞的规定的功能性的细胞(在本说明书中简称为“分化细胞”。)；及(n)具有成为实质细胞或非实质细胞的分化能力或虽然确定了分化的命运(已定向)、但未分化，或者处于干细胞或祖细胞的阶段、且未充分地具有作为实质细胞或非实质细胞的规定的功能性的细胞(在本说明书中简称为“未分化细胞”。)。[0081]作为“构成器官的细胞”，可使用选自实质细胞的分化细胞、实质细胞的未分化细胞、非实质细胞的分化细胞及非实质细胞的未分化细胞组成的组中的至少1种的细胞，优选能够形成器官的类器官(优选为器官芽)的2种以上细胞的组合。[0082]作为已分化的“实质细胞”，例如可举出：肝脏的肝细胞、胰脏的内分泌细胞(例如α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞、pp细胞)及胰管上皮细胞、肾脏的肾小管上皮细胞及肾小球上皮细胞、肺的肺泡上皮细胞、心脏的心肌细胞、肠道的上皮细胞、脑的神经细胞及胶质细胞、脊髓的神经细胞及雪旺细胞(schwann cell)等。[0083]作为已分化的“非实质细胞”，例如可举出：肝脏的肝窦内皮细胞、肝星状细胞及枯否细胞(kupffer cell)、胰脏的胰星状细胞及胰微血管内皮细胞、肾脏的肾小球内皮细胞、肺的肺动脉内皮细胞及肺成纤维细胞、心脏的心微血管内皮细胞、大动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞及心成纤维细胞、肠道的肠管微血管内皮细胞、脑的脑微血管内皮细胞、血管周细胞、脉络丛内皮细胞及脑血管外膜成纤维细胞等。[0084]作为具有成为实质细胞或非实质细胞的分化能力的“未分化细胞”，例如可举出：能够分化为脑、脊髓、肾上腺髓质、表皮、毛发·指甲·皮肤腺、感觉器官、末梢神经、晶状体等外胚层器官的细胞；能够分化为肾脏、输尿管、心脏、血液、生殖腺、肾上腺皮质、肌肉、骨骼、真皮、结缔组织、间皮等中胚层器官的细胞；能够分化为肝脏、胰脏、肠道、肺、甲状腺、甲状旁腺、尿道等内胚层器官的细胞等。[0085]构成器官的细胞可以是原代培养细胞，也可以是传代培养细胞(株系化细胞)，也可以是使es细胞、ips细胞等分化所得到的细胞。[0086]器官的类器官及/或构成器官的细胞(器官的类器官等)可以来源于人，也可以来源于人以外的动物(例如小鼠、大鼠、狗、猪、猴等哺乳动物)。即，器官的类器官等可以来源于人，也可以来源于人以外的动物。从在人类的医药开发中检测出在现有的动物实验、人细胞试验等中所难以发现的引起药物中毒的药物的观点考虑，类器官优选来源于人。对于为了制备器官的类器官而根据需要与构成器官的细胞一起使用的其他细胞(血管内皮细胞、间充质细胞等)而言，也是同样的。[0087]作为本发明的培养方法为适用对象的器官的类器官的器官或组织的种类，只要对应于用途即可，没有特别限定。以下，举出肝类器官及肾类器官作为具体例，但是，对于胰脏、甲状腺、甲状旁腺、肺、脑、心脏、其他器官的类器官，也可同样地实施本发明。[0088]在本发明的一个优选实施方式中，器官的类器官为肝类器官(优选为肝芽)，构成器官的细胞为构成肝脏的细胞(肝脏的实质细胞及/或非实质细胞)。肝类器官(肝芽)可根据例如在wo2013/047639、wo2015/129822等中所记载的方法，通过将肝脏内胚层细胞(相当于肝脏的实质细胞的未分化细胞)、血管内皮细胞及间充质细胞(优选为间充质干细胞)进行共培养而制备。[0089]在“构成肝脏的细胞”中，肝脏的实质细胞(肝细胞)包括已分化的肝细胞(分化肝细胞)、以及虽然确定了分化成肝细胞的命运但尚未分化成为肝细胞的细胞(未分化肝细胞)的所谓肝祖细胞(例如肝脏内胚层细胞)这两种概念。分化肝细胞可以是从生物体采集(从生物体内的肝脏分离)的细胞，也可以是使es细胞、ips细胞等多能干细胞、肝祖细胞、其他具有分化成肝细胞的能力的细胞分化而得到的细胞。未分化肝细胞可以是从生物体采集的细胞，也可以是使es细胞、ips细胞等多能干细胞、其他干细胞或祖细胞分化而得到的细胞。可分化为肝细胞的细胞例如可根据k.si-taiyeb等，hepatology,51(1):297-305(2010)、t.touboul等，hepatology.51(5):1754-65(2010)而制备。使es细胞、ips细胞等多能干细胞、肝祖细胞、其他具有分化为肝细胞的能力的细胞分化为肝细胞的方法是已知的，例如可根据hepatology,2010；51(1):297-305、cell rep.2017；21(10):2661-2670等所记载的方法，由ips细胞进行。对于从生物体采集的细胞群、通过es细胞、ips细胞等的分化诱导所制备的细胞群(特别是后者)，都可以使用分化肝细胞的纯度高的细胞群或未分化肝细胞的纯度高的细胞群，也可使用以任意比例包含分化肝细胞及未分化肝细胞的细胞混合物。[0090]某细胞是否为分化肝细胞，可通过成熟肝细胞标志物、例如以去唾液酸糖蛋白受体1(asgr1)、谷氨酰胺合成酶(gs)、e-钙粘蛋白，作为未成熟肝细胞标志物(初期肝分化标志物)的α甲胎蛋白(afp)、作为初期肝分化标志物的白蛋白(alb)、视黄醇结合蛋白(rbp4)、转甲状腺素蛋白(ttr)、葡萄糖6-磷酸酶(g6pc)等中的1种或2种以上的表达是否为阳性来进行判别。另一方面，某细胞是否为未分化肝细胞，可通过以hhex、sox2、hnf4α、afp、alb等中的1种或2种以上的细胞标志物的表达是否为阳性(对于alb而言，为弱阳性)来判别。[0091]“血管内皮细胞”为包括造血性血管内皮细胞(hemogenic endothelial cell；hec)及非造血性血管内皮细胞(non-hemogenic endothelial cell；non-hec)这两种概念的用语。hec为可产生造血干细胞(具有造血能力)的血管内皮细胞，也被称为血细胞产生型血管内皮细胞。另一方面，non-hec为不具有该造血能力的血管内皮细胞。通过使用血管内皮细胞，可赋予器官的类器官微细的血管网。[0092]血管内皮细胞可以是从生物体采集的血管内皮细胞(例如，微血管内皮细胞(microvessel endothelial cells，mvec)、肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells，lsec)、脐静脉内皮细胞(umbilical-vein endothelial cells，uvec)等)的纯度高的细胞群，也可以是使es细胞、ips细胞等多能干细胞、其他具有分化成血管内皮细胞的能力的细胞分化而得到的血管内皮细胞的纯度高的细胞群。[0093]使es细胞、ips细胞等多能干细胞、其他具有分化成血管内皮细胞的能力的细胞分化成为造血性血管内皮细胞(hec)的方法是已知的，例如可根据plos one,2013；8(4):e59243、nat biotechnol.2014；32(6):554-61、sci rep.2016；6:35680等记载的方法，由ips细胞进行。[0094]某细胞是否为血管内皮细胞，可通过以例如tie2、vegfr-1、vegfr-2、vegfr-3、cd41等血管内皮细胞的标志物中的1种或2种以上是否为阳性(如果为阳性，则为血管内皮细胞)来判别。另外，某细胞是否为已分化的血管内皮细胞，可进一步通过cd31、cd144等标志物中的1种或2种以上是否为阳性(如果为阳性则为已分化的血管内皮细胞)来判别。[0095]“间充质细胞”是指主要存在于来源于中胚层的结缔组织、形成于组织中发挥功能的细胞的支持结构的结缔组织细胞，是包括已分化的细胞(分化间充质细胞)、以及虽然确定了分化成间充质细胞的命运但尚未分化成间充质细胞的细胞(未分化间充质细胞)的所谓的间充质干细胞这两种概念的用语。不过，“血管内皮细胞”虽然也是由未分化间充质细胞所分化的细胞的一种，但需要从本说明书中所定义的“间充质细胞”中排除。[0096]某细胞为未分化间充质细胞还是分化间充质细胞可通过例如stro-1、cd29、cd44、cd73、cd90、cd105、cd133、cd271、nestin等未分化间充质细胞的标志物中的1种或2种以上是否为阳性(如果为阳性，则为未分化间充质细胞；如果为阴性，则为分化间充质细胞)来判别。[0097]间充质细胞还可以是根据本发明中作为目标的器官的类器官、组合使用的“构成器官·组织的细胞”而进一步与特定器官(组织)具有特异性的细胞标志物的细胞。作为这样的细胞标志物，例如可举出作为原始横隔(septum transversum mesenchyme)(stm)的细胞标志物的foxf1、col4a及alcam。[0098]在本发明的一个优选实施方式中，器官的类器官为肾类器官(优选为肾脏原基)，构成器官的细胞为构成肾脏的细胞(肾脏的实质细胞及/或非实质细胞)。肾类器官及肾脏原基可根据例如在wo2013/047639、wo2015/129822等中所记载的方法，通过将肾脏或后肾的细胞、血管内皮细胞及间充质细胞(优选为间充质干细胞)进行共培养而制备。在肾类器官(肾脏原基)的制备中所使用的血管内皮细胞及间充质细胞与在上述肝类器官(肝芽)的制备中所使用的相同。[0099]在“构成肾脏的细胞”中，肾脏的实质细胞(肾小球内皮细胞、肾小球上皮细胞、近曲小管细胞、髓袢(loop of henle)细胞、远曲小管细胞)包括已分化为实质细胞的细胞(分化肾细胞)、以及虽然确定了分化成实质细胞的命运但尚未分化的细胞(未分化肾细胞)的所谓的肾祖细胞这两种概念。分化肾细胞可以是从生物体采集(从生物体内的肾脏等分离)的细胞，也可以是使es细胞、ips细胞等多能干细胞、肾祖细胞、其他具有分化成肾脏的实质细胞的能力的细胞分化所得到的细胞。未分化肾细胞可以是从生物体采集的，也可以是使es细胞、ips细胞等多能干细胞、其他干细胞或祖细胞分化而得到的。可分化为肾细胞的细胞例如可根据morizane等，nat protoc12:195-207(2017)、taguchi等，cell stem cell 14(1):53-67(2014)、narayanan等，kidney int.83(4):593-603(2013)等而制备。使es细胞、ips细胞等多能干细胞、肾祖细胞、其他具有分化为肾细胞的能力的细胞分化为肾细胞的方法是已知的，例如可与上述同样地根据morizane等，nat protoc 12:195-207(2017)、taguchi等，cell stem cell14(1):53-67(2014)、narayanan等，kidney int.83(4):593-603(2013)等的记载，由ips细胞进行。对于从生物体采集的细胞群、通过es细胞、ips细胞等的分化诱导所制备的细胞群(特别是后者)，都可以使用分化肾细胞的纯度高的细胞群或未分化肾细胞的纯度高的细胞群，也可使用以任意比例包含分化肾细胞及未分化肾细胞的细胞混合物。[0100]某细胞是否为分化肾细胞，可通过成熟肾细胞标志物，例如podxl、ltl、cdh1等中的1种或2种以上的表达是否为阳性来判别。另一方面，某细胞是否为未分化肾细胞，可通过six2、sall1等中的1种或2种以上的细胞标志物的表达是否为阳性来判别。[0101]在本发明的一个优选实施方式中，器官的类器官具有脉管结构，及/或构成上述器官的细胞与脉管细胞共存。所谓的“具有脉管结构”具体是指，在类器官的制备中，通过使构成器官的细胞与脉管细胞共存(共培养)，而在器官的类器官中形成微细的脉管结构。[0102]作为“脉管细胞”，例如可举出血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及周细胞。例如，通过将肝脏内胚层细胞(相当于肝脏的实质细胞的未分化细胞)、血管内皮细胞及间充质细胞(优选为间充质干细胞)进行共培养，可制备具有脉管结构的肝类器官。另外，通过将肾脏或后肾的细胞、血管内皮细胞及间充质细胞(优选为间充质干细胞)共培养，可制备具有脉管结构的肾类器官。[0103]对于由构成器官的细胞及根据需要使用的其他细胞是否能得到器官的类器官，例如可通过以肉眼或显微镜观察而确认是否形成立体结构(三维结构)，从而判断。另外，器官的类器官的制备除这样的立体结构的形成外，还可以根据规定的细胞标志物、特别是器官的实质细胞的标志物是否为阳性(例如阳性细胞的比例是否超过规定基准)，并根据需要而进一步以培养上清液中是否分泌这些标志物的蛋白质(例如分泌量是否超过规定基准)来判别。例如，如果为肝类器官或肝芽，则可将“hhex、sox2、afp、alb、hnf4α等标志物的表达是否为阳性”及/或“培养上清液中是否分泌白蛋白(alb)”用于判断。如果为肾类器官或肾脏原基，则可将six2、sall1、podxl、ltl、cdh1等的标志物的表达是否为阳性用于判断。[0104]《固定化·基质》[0105]在本发明的培养方法中，器官的类器官及/或构成器官的细胞(器官的类器官等)被固定化在腔室内。用于“固定化”的手段没有特别限定，只要能够使器官的类器官等不会因以在腔室内产生湍流的方式灌注的培养液而流失至腔室外即可。例如，可以通过将腔室底部的全部或一部分以基质(与用于包埋器官的类器官等的相同，后文详述。)或与类似于该基质的支架材料等被覆，并在该被覆物上接种器官的类器官等(用于制备器官的类器官的规定细胞)进行平板培养，将器官的类器官等固定化在腔室内。另外，如后述的本发明的优选实施方式那样，将器官的类器官等包埋于基质中，例如将包埋有器官的类器官等的基质悬挂于通气性膜，也是用于将器官的类器官等固定化在腔室内的合适手段。[0106]在本发明的一个优选实施方式中，器官的类器官及/或构成器官的细胞(器官的类器官等)以被包埋在基质中的状态被固定化。[0107]作为用来包埋器官的类器官等的“基质”，可使用在室温以上为固体，且能够用于细胞培养、特别是能够用于三维细胞培养的通常的细胞外基质。细胞外基质基本上以纤维状蛋白质及蛋白多糖为主成分，作为这样的成分，可举出：弹性蛋白、巢蛋白、骨粘连蛋白、胶原蛋白(iv型胶原蛋白等)、腱蛋白、血小板反应蛋白、串珠素、玻连蛋白、原纤维蛋白、纤维粘连蛋白、肝素(硫酸盐)、层粘连蛋白等。例如，作为商品名为“matrigel”(corning)而已知的含有层粘连蛋白、胶原蛋白(iv型胶原蛋白)及巢蛋白、且一并含有egf、igf-1、pdgf、tgf-β等生长因子的基底膜基质为本发明中优选基质的一个例子。另外，作为水凝胶而已知的自组装肽，例如包括精氨酸、甘氨酸及天冬酰胺的水凝胶等也可用作本发明的基质。基质可使用任1种，也可将2种以上混合或不混合(以在固化时形成不同的层的方式)使用。[0108]对于基质的组成、浓度(原液、或稀释物)，本领域技术人员可以以使包埋有器官的类器官等的基质(以下称为“基质组合物”。)成为具有适当的硬度的方式进行适当调整。例如，为了提高操作性并使固化时具有适当的硬度，基质(例如基质胶)可根据需要与培养液混合使用。作为这样的实施方式中用于与基质混合的培养液，可使用与本发明的培养方法中用于灌注、培养器官的类器官等的培养液相同的培养液。[0109]一般而言，基质组合物可通过在包含器官的类器官等的培养液中添加含有适当成分的适量基质后，使基质固化(根据需要添加用于使水凝胶固化的离子性溶液或离子性分子)而制备。例如，通过将在4℃以下为液体状态的基质(例如基质胶)与器官的类器官等搅拌混合后，于37℃以上静置使基质固化，从而能够得到基质组合物。在向器官的类器官等悬浮的较多量的培养基中添加基质的情况下，优选：通过添加充分量的基质，从而使基质的硬度充分，使器官的类器官等不沉降至底部而保持于基质中。[0110]基质组合物可以是例如下述的(i)～(iii)中的任一种。[0111](i)通过由规定的细胞制备器官的类器官后，将该类器官分离，与基质混合，从而得到。[0112](ii)通过以三维培养而由规定的细胞制备器官的类器官后，将该器官的类器官与基质混合，从而得到。[0113](iii)通过在包含用于制备器官的类器官的规定的细胞(构成器官的细胞)的细胞群中添加基质并固化后，将被包埋于基质中的状态的细胞群进行培养并制备器官的类器官，从而得到。[0114]作为将被包埋于基质中的状态的器官的类器官及/或构成器官的细胞(器官的类器官等)、即基质组合物固定化在腔室内的手段，没有特别限定。以灌注的培养液能以湍流的状态与包埋器官的类器官等的基质接触的方式，配置于腔室内的合适的位置即可。在本发明中，例如可通过将固定化前的器官的类器官等与基质的混合物滴加到腔室内的合适的位置，并将基质固化，从而使器官的类器官等(以包埋在基质中的状态)固定化在腔室内。[0115]在本发明的一个优选实施方式中，包埋有器官的类器官及/或构成器官的细胞的基质(基质组合物)以悬挂于通气性膜的状态而固定化在腔室内。[0116]“通气性膜”为至少具有透氧性，并根据需要而进一步具有对二氧化碳、其他期望的气体具有透过性的膜。各种通气性膜是已知的，例如可举出以聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚二甲基硅氧烷(pdms)、氟碳、聚四氟乙烯(ptfe)、聚氨酯等纤维所制备的膜。通气性膜可根据需要而进行提高或降低细胞粘附性的表面处理，例如以胶原蛋白等ecm涂覆的处理。另外，通气性膜也可以是根据需要而与由和通气性膜不同的纤维制成的多孔质膜(网)所层叠而成的(混合膜)。[0117]“悬挂于通气性膜的状态”的基质组合物可通过下述方式制备：通过将固化前的基质组合物滴于通气性膜上并使其固化后，将附着于通气性膜的状态的已固化基质组合物以成为向下(朝下凸出)的方式上下颠倒。通过将基质组合物为悬挂状态的通气性膜用保持件等合适的部件而固定化在腔室内(例如顶部)，从而可使基质组合物浸渍于灌注的培养液中，另一方面，通气性膜可不浸渍地置于大气中(或期望的培养气氛中)，由此，可以对被包埋于基质中的器官的类器官等在确保经由通气性膜的气体交换的同时进行培养。[0118]《培养液》[0119]在本发明中所灌注的培养液(液体培养基)只要选择对应于器官的类器官及/或构成器官的细胞(器官的类器官等)的种类的合适的培养液即可。器官的类器官等的培养基是已知的，一般而言，可使用将培养被用于制备器官的类器官的构成器官的细胞(通常为混合有多种细胞的细胞群)所使用的培养基混合而得的产物。例如，在培养肝类器官及/或构成肝脏的细胞的情况下，可使用肝细胞用的培养基与血管内皮细胞用的培养基的混合培养基，在培养肾类器官及/或构成肾脏的细胞的情况下，可使用肾细胞用的培养基及血管内皮细胞用的培养基的混合培养基。[0120]作为血管内皮细胞用的基础培养基，例如可举出：dmem/f-12(gibco)、stempro-34sfm(gibco)、essential 6培养基(gibco)、essential 8培养基(gibco)、egm(lonza)、bulletkit(lonza)、egm-2(lonza)、bulletkit(lonza)、egm-2mv(lonza)、vasculife engs comp kit(lct)、human endothelial-sfm basal growth medium(invitrogen)、人微血管内皮细胞增殖培养基(toyobo)等。作为血管内皮细胞用的添加物，例如可举出选自由b27supplements(gibco)、bmp4(骨形态发生因子4)、gskβ抑制剂(例如chir99021)、vegf(血管内皮细胞生长因子)、fgf2(成纤维细胞生长因子，fibroblast growth factor(也称为bfgf(碱性成纤维生长因子，basic fibroblast growth factor)))、folskolin、scf(干细胞因子，stem cell factor)、tgfβ受体抑制剂(例如sb431542)、flt-3l(fms样酪氨酸激酶3配体抗体，fms-related tyrosine kinase 3ligand)、il-3(白细胞介素3)、il-6(白细胞介素6)、tpo(血小板生成素)、hegf(重组人表皮细胞生长因子)、氢化可的松、抗坏血酸、igf1、fbs(胎牛血清)、抗生素(例如，庆大霉素、两性霉素b)、肝素、l-谷氨酰胺、酚红及bbe组成的组中的1种以上。[0121]作为肝细胞用的基础培养基，例如可举出rpmi(fujifilm corporation)、hcm(lonza)等。作为肝细胞用的添加物，例如可举出选自wnt3a、激活素a、bmp4、fgf2、fbs、hgf(肝细胞生长因子)、抑瘤素m及地塞米松组成的组中的1种以上。在肝细胞用的培养基中可根据需要而添加选自抗坏血酸、bsa-faf、胰岛素、氢化可的松及ga-1000中的至少1种。更具体而言，作为肝细胞用的培养基，例如可举出：从hcm bulletkit(lonza)中除去了hegf(重组人表皮细胞生长因子)的培养基；在rpmi1640(sigma-aldrich)中添加有1％ b27 supplements(gibco)及10ng/ml hhgf(sigma-aldrich)的培养基。特别是，在制备肝芽的情况下，例如也可使用下述培养基：在将egm bulletkit(lonza)及从hcm bulletkit(lonza)中除去了hegf(重组人表皮细胞生长因子)的培养基以1:1混合而成的培养基中，添加地塞米松、抑瘤素m及hgf而得的培养基。[0122]作为肾细胞用的基础培养基，例如可举出reproff2(reprocell)、stemfit basic(味之素株式会社)等。作为肾细胞用的添加物，例如可举出fgf9。在肾细胞用的培养基中，可根据需要而添加选自由chir及肝素组成的组中的1种以上。更具体而言，作为肾细胞用的培养基，例如可举出在reproff2中添加有10ng/ml fgf9(r;d)的培养基。特别是，在制备肾脏原基时，例如也可使用在reproff2中添加有3μm chir及10ng/ml fgf9(r;d)的培养基。[0123]培养液(液体培养基)的粘度只要能进行灌注就没有特别限定，但是，从在腔室中容易产生湍流的观点来看，在培养条件下(例如约37℃)的温度中，例如为0.7～0.8mpa·s是优选的。[0124]《培养条件等》[0125]关于本发明的培养方法的其他条件，例如气氛、温度、时间等，可根据实施本发明的培养方法的目的、器官的类器官等的实施方式而适当调整。例如，为了从构成器官的细胞及根据需要而使用的其他细胞来形成作为肝脏、肾脏等的器官的类器官的立体结构或其器官芽(原基)，可在5％co2、30～40℃(优选为约37℃)进行1～10日(如果为器官芽(原基)，则为1～3日)。[0126]《药物》[0127]在本发明的一个优选实施方式中，培养液含有药物。“药物”只要是对器官的类器官等发挥作用、或用于分析是否发挥作用的物质，就没有特别限定，可根据目的而进行选择。“药物”只要可用作小分子药物、抗体药物、肽药物、核酸药物等医药品的有效成分，就没有特别限定。需要说明的是，也可将在肝动脉化疗栓塞术中用于栓塞血管的物质(明胶海绵、多孔质明胶粒等)作为培养液、特别是器官的类器官的脉管结构中的培养液所含的药物，或者也可以作为如后述的使用(可移植至非人动物)的立体器官的药物评价方法中的药物。“药物”并不限定于实际上作为医药品而市售的药物，也可以是在临床试验或非临床试验中所用的药物、或在其之前的阶段的开发中的药物(医药品的有效成分的候选)。[0128]例如，各器官的缺血性疾病(伴随缺血的疾病)、梗塞〃坏死性疾病、或出血性疾病(在本说明书中，将这些疾病统称为“缺血性疾病等”。)的治疗用的药物是本发明的优选药物之一。在与各器官对应的类器官等的培养液中，可添加该器官的缺血性疾病等的治疗药而进行培养。作为肝脏的缺血性疾病等，例如可举出：缺血性肝损伤(缺血性肝炎)、缺血性胆管损伤、肝破裂(由于癌、外伤、感染症等造成的二次性出血)。作为肾脏的缺血性疾病等，例如可举出缺血性肾损伤、特发性肾出血。作为在日本等国所承认的缺血性肾损伤的治疗药，可举出如依库珠单抗(eculizumab)。作为胰脏的缺血性疾病等，例如可举出缺血性急性胰腺炎、缺血性慢性胰腺炎。作为甲状腺或甲状旁腺的缺血性疾病等(血流量减少等)，例如可举出亚急性甲状腺炎、无痛性甲状腺炎。作为心脏的缺血性疾病等，例如可举出缺血性心脏疾病。作为在日本等国所承认的缺血性心脏疾病的治疗药而言，可举出例如硝酸异山梨酯。作为脑的排斥性疾病等，例如可举出脑缺血。[0129]另外，从其他方面来看，作为安全性评价用药物，在各器官有伴随缺血或出血的副作用的担忧的药物也为本发明的优选药物。作为副作用有伴随缺血的担忧的药物，例如可举出对肝脏造成严重的药物性肝损伤的抗癌剂、抗病毒药、乙酰氨基酚等，此外还可举出抗菌药物(涵盖多种器官)、强心药、甾体(心脏)、利尿药、肾素-血管紧张素系统(ras)抑制剂、造影剂、sglt2抑制剂(肾脏)等；作为副作用有伴随出血的担忧的药物，例如可举出抗血小板药、血栓溶解药等。[0130]-药物评价方法-[0131]本发明的培养方法可应用于通过使用含有药物的培养液来评价该药物的方法。关于以怎样的观点来评价药物并没有特别限定，例如当药物为用于治疗各器官的缺血性疾病等的药物的情况下，可评价其治疗的有效性。另外，当药物为在各器官中有伴随缺血或出血的副作用的担忧的药物的情况下，可评价药物的安全性。[0132]即，本发明的使用器官的类器官等的药物评价方法包括使用含有如上所述的药物的培养液来实施本发明的培养方法的步骤(以下称为“药物添加培养步骤”。)，并进一步包括评价药物对于器官的类器官的有效性及/或安全性的步骤。[0133]更具体而言，作为依据本发明的药物有效性的评价方法(在本说明书中有时称为“药效评价方法”。)，例如可举出包括药物添加培养步骤的药物评价方法，所述药物添加培养步骤是使用含有用于治疗肝脏、肾脏等的缺血性疾病等的药物的培养液来实施的。另外，作为依据本发明的药物安全性的评价方法，例如可举出包括药物添加步骤的药效评价方法，上述药物添加步骤是使用在各器官有伴随缺血或出血的副作用的担忧的药物来实施的。[0134]药物添加培养步骤中的培养条件(气氛、温度、时间等)基本上可与本发明的培养方法中的培养条件相同，并可根据需要而适宜调节，例如可调整成对进行对应药物的评价而言为充分的培养时间。[0135]本发明的药物评价方法也可根据需要而包括药物添加培养步骤以外的步骤。例如，可包括评价药物的有效性及/或安全性的步骤，该步骤为：对于经过药物添加培养步骤的包含于器官的类器官等所含的细胞，(i)使用试剂(例如碘化丙啶；pi)以检测死亡细胞，并测定细胞中的死亡细胞的比例(细胞死亡率)，及/或(ii)测定反映出治疗对象的疾病的症状的生物标志物的产生量(例如培养上清液中的特定物质的浓度)，并与对照组进行比较。[0136]在本发明的药物评价方法中，器官的类器官等优选来源于成为药物的治疗对象的疾病已发作的患者(人)或其他对象。在此实施方式中，构成器官的细胞及根据需要而使用的其他细胞可以是从这样的患者或对象采集的细胞(原代培养细胞)，也可以是使用其制备而得的ips细胞或传代培养细胞(株系化细胞)。例如，以本发明的药物评价方法为标准，为了制备器官的类器官、即为了分化诱导成制备器官的类器官所用的构成器官的细胞及根据需要使用的其他细胞，使用从缺血性疾病等的患者采集的细胞制备而得的ips细胞株是优选的。[0137]本发明的药物评价方法在以如后述的制造方法所得到的立体器官来取代器官的类器官等(器官的类器官及/或构成器官的细胞)作为对象的情况下，也可以按同样方式进行。例如，在本发明的一个优选实施方式中，使用立体器官的本发明的药物评价方法可设为包括：在立体器官的培养基中添加药物的步骤、及评价药物对于立体器官的有效性(药效)及/或安全性的步骤。[0138]需要说明的是，本发明也提供一种药物评价方法，其包括：对移植有立体器官的非人动物进行给药的步骤、及评价药物对于该立体器官的有效性及/或安全性的步骤。[0139]-立体器官的制造方法-[0140]本发明的立体器官的制造方法包括实施如上所述的本发明的器官的类器官等的培养方法的步骤。“立体器官”也被称为成熟器官的类器官，其为包含比器官的类器官更进一步成熟的细胞群或结构的结构体。[0141]本发明的立体器官的制造方法中的培养条件(气氛、温度、时间等)基本上可设为与本发明的培养方法中的培养条件相同，并可根据需要而适宜调节，例如设为对形成立体器官而言为充分的培养时间。例如，在制造肝脏、肾脏等立体器官的情况下，可举出：从开始培养用于制备各器官的类器官的规定细胞之日算起，进行20～30日的培养；或从可确认到形成作为这些器官的类器官的立体结构之日算起，为了使其成熟而进一步培养10～20日等。[0142]是否从器官的类器官得到立体器官例如可基于下述中的一个或多个观点来判定：从结构体中细胞的密度(是否超过规定基准等)、结构体的立体形状(是否比一定水平更为立体等)、功能或性状(是否获得代谢功能等规定的功能性或性状等)、细胞标志物(细胞标志物的基因或蛋白质的表达是否为阳性，阳性细胞的密度是否超过规定基准，培养上清液中的标志物蛋白质分泌量是否超过规定基准等)等。上述的细胞密度、立体形状、功能或性状、细胞标志物等可根据器官的类器官及立体器官而适宜设定，例如，可以将是否达成生物体内的器官相同的程度、或与生物体内的器官的程度近似的水平来作为上述那样的判定的基准。[0143]例如，在制备作为立体器官的肝脏时，可将下述基准用于判断：谷氨酰胺、柠檬酸产生或糖异生等代谢功能的获得、asgr1和药剂代谢酶(cyp3a4、cyp7a1)等标志物的表达是否为阳性、例如asgr1阳性细胞是否以70％以上的密度存在。在制备作为立体器官的肾脏的情况下，可使用podxl、ltl、cdh1等标志物；纤毛蛋白(pkd1、pkd2、nphp1、nphp6、pkhd1)、运输蛋白(slc34a1、atp1a1、slc6a19、slc9a3、slc2a2、abcb1、lrp2)等的表达的一部分或多个是否为阳性来判断。[0144]基于立体器官，可通过与体外循环连接，从而制备人工器官。这样的人工器官可用作器官障碍模型、或用于评价器官的功能。这样的用途可参照例如wo2013/047720等。[0145]-培养系统-[0146]本发明的培养系统可固定并收容器官的类器官及/或构成器官的细胞(器官的类器官等)，该培养系统具有：“腔室”，其具有用于对器官的类器官等灌注培养液的流入口及流出口；及用于灌注培养液的“灌注机构”；灌注机构以使培养液在腔室内产生湍流的方式进行控制。[0147]关于腔室，其与本发明的“器官的类器官等的培养方法”的关系如上所述，本发明的培养系统使用这样的腔室或设置有这样的腔室的培养容器(细胞培养装置)。[0148]作为本发明的培养系统中的灌注机构，可采用将类器官等或其他组织、细胞等灌注培养所用的通常或已知的机构。关于灌注机构，典型而言，作为基本构成，包含：用于输送培养液的泵(蠕动泵等)或其他送液机构、用于贮留培养液的贮液槽(reserver)、及分别将贮液槽与泵等、泵等与腔室的流入口、腔室的流出口与贮液槽进行连接的流路(管等)等。[0149]灌注机构、特别是泵等送液机构优选以能自动将流量等在任意(预先设定的)时机变更的方式来进行控制。例如，在本发明的一个优选实施方式中，灌注机构以如下方式控制：以分别包含(i)在腔室内从层流向湍流转移的时间、(ii)产生湍流的时间、(iii)从湍流向层流转移的时间的方式灌注培养液。在该实施方式中，可以在上述(i)～(iii)的时间上再加上(iv)产生层流(也可以是静止)的时间，并连续重复这些时间来进行控制。例如，可将“以第1流量等送液规定时间或不送液规定时间(相当于第1流量等为零的情况)、继而以第2流量等送液规定时间”设为1个循环，并重复进行规定的循环数(经过规定时间)。需要说明的是，灌注机构、特别是泵等送液机构的控制程序也可作为构成本发明的培养系统的一部分。[0150]本发明的培养系统也可根据需要具有通常或已知的灌注培养用的培养系统所用的其他机构、构成等。作为这样的机构、构成等，例如可举出将培养环境保持于适当温度及气氛的机构(温度控制装置·机制、气氛控制装置·机制等)。[0151]【实施例】[0152][实施例1][0153][1]人非造血性血管内皮细胞的制备[0154]通过将人ips细胞(1383d2；京都大学ips研究所)在于dmem/f-12(gibco)(10ml)中添加有1％ b-27supplements(gibco)、bmp4(25ng/ml)及chir99021(8μm)而得的培养基中，于5％co2、37℃下培养3日，从而诱导中胚层系细胞。通过将所得到的中胚层细胞进一步在于stempro-34sfm(gibco)(10ml)中添加有vegf(200ng/ml)及folskolin(2μm)而得的培养基中，于5％co2、37℃培养7日，从而得到cd31阳性、cd73阳性及cd144阳性的人非造血性血管内皮细胞群。[0155][2]人肝脏内胚层细胞的制备[0156]通过将人ips细胞(1383d2；京都大学ips研究所)在于基础培养基rpmi(fujifilm corporation)(2ml)中添加有wnt3a(50ng/ml)及激活素a(100ng/ml)而得的培养基中，于5％co2、37℃培养5日，诱导内胚层系细胞。在上述基础培养基中添加1％ b27supplements(gibco)及fgf2(10ng/ml)，将所得到的内胚层系细胞于5％co2、37℃进一步培养5日，从而得到afp、alb及hnf4α为阳性的人肝脏内胚层细胞群。[0157][3]人间充质细胞的制备[0158]通过将人ips细胞(1383d2；京都大学ips研究所)在于基础培养基dmem/f-12(gibco)(10ml)中添加有1％ b-27supplements(gibco)、bmp4(25ng/ml)及chir99021(8μm)而得的培养基中，于5％co2、37℃下培养3日，从而诱导中胚层系细胞。在相同培养基中添加pdgfbb及激活素a，将所得到的中胚层系祖细胞于5％co2、37℃进一步培养3日。回收培养后的细胞，再次接种于新的明胶包被板，在上述基础培养基中添加bfgf及bmp4，并于5％co2、37℃进一步培养4日，由此得到foxf1、col4a、alcam及cd73为阳性的人间充质细胞群。[0159][4]对细胞外基质的细胞包埋及基质组合物的制备[0160]配制将在hcm(lonza公司制)中添加有fbs、hgf、osm及dex的肝诱导培养基与egm(lonza)以1:1的体积比例混合成的培养基(本说明书中称为“类器官用培养基”)。需要说明的是，配制将类器官用培养基与基质胶(bd pharmingen)以1:1的体积比例混合成的基质(本说明书中称为“类器官用培养基/基质胶混合基质”)。[0161]将类器官用培养基/基质胶混合基质5μl滴于翻转的hanging drop insert(millipore)上，并通过提高温度至37℃而使其固化，形成“第三基质层”。[0162]将以如上述方式制备的人肝脏内胚层细胞、人非造血性内皮细胞及人间充质细胞以10:7:1的比例在类器官用培养基/基质胶混合基质内于4℃进行混合。将所得到的混合液3μl滴在如上所述形成的第三基质层上，并通过提高温度至37℃使其固化，形成“第二基质层”。[0163]进而，将类器官培养基/基质胶混合液8μl滴在如上所述形成的第二基质层上，并通过提高温度至37℃使其固化，形成“第一基质层”。[0164]在低吸附24孔板中，加入600μl的添加有rock(rho-associated coiled-coil forming kinase)抑制剂(10ng/ml)的类器官培养基。将如上所述地形成于hanging drop insert上的包含第一～第三基质层的基质组合物朝向孔内的培养基的方向而插入。24小时后，用除去rock抑制剂(10ng/ml)的类器官培养基进行半量更换，后续的培养基交换以每日半量换液直到培养开始后的第3日为止而实施。[0165][5]灌注培养[0166]在培养开始后第3日，将附着有包含类器官的基质组合物的hanging drop insert取出，并使用包含培养腔室及供给培养基罐的quasivivo qv600 barrier sys.starter kit(kirkstall公司)，开始灌注培养。输送培养液的泵使用watson marlow公司制的管式泵(tubing pump)(530sn/313d)，泵侧管连接于tygon管lmt-55(内径8mm×外径11mm)。每隔30秒实施30秒20ml/分钟的送液，从而间歇地实施灌注。将装置的简图示于图1。在上述的灌注中，以目视确认到在培养腔室内产生湍流的漩涡(参照图2)。用类器官培养基于5％co2、37℃培养11日，每3日更换一次培养基罐内的类器官培养基，由此实施培养基更换。[0167]在灌注培养开始后第11日，将附着有包含类器官的基质组合物的hanging drop insert取出，并通过细胞刮刀将类器官剥离。将类器官放入包含4％多聚甲醛/pbs固定溶液的2ml管中，进行固定。[0168][6]静态培养(对照)[0169]作为对照组，使用与上述相同的包含类器官的基质组合物及类器官培养基，通过现有的通常的静态培养，即不进行自培养开始后第3日起的灌注培养，而是继续在低吸附24孔板中进行与上述相同时间的培养后，同样地进行固定。[0170][7]免疫染色(asgr1等)[0171]去除固定溶液后，用pbs进行清洗(15分钟×2次)，并进行以20％ dmso/乙醇、80％乙醇、50％乙醇分别处理15分钟的透过处理。进而，使用抗asgr1抗体(r;d,mab4394)、抗cd31抗体(abcam,ab28364)及与这些抗体结合的荧光标记二抗(novex donkey anti-mouse igg(h+l)secondary antibody、novex donkey anti-rabbit igg(h+l)secondary antibody(invitrogen))及核染色试剂(dapi)进行免疫染色，并利用visikol histo-m(visikol inc.)进行透明化处理。通过lsm880共聚焦激光显微镜(zeiss)实施所得到的染色检体的荧光图像观察，从所得到的荧光图像制作二值化的asgr1荧光区域面积，除以同样经二值化的dapi荧光区域面积，由此算出asgr1阳性率。将结果示于图3。[0172][实施例2][0173]使用与实施例1的[1]～[3]同样地制备的人肝脏内胚层细胞、人非造血性内皮细胞及人间充质细胞，与实施例1的[4]及[5]同样地操作，通过基质组合物的灌注培养而得到类器官后，进行固定。另外，作为对照，与实施例1的[6]同样地操作，通过基质组合物的静态培养而得到类器官后，进行固定。将灌注培养及静态培养各自得到的包含类器官的基质组合物的观察图像(立体结构)示于图4。[0174][8]免疫染色(gs、e-钙粘蛋白等)[0175]去除固定溶液后，用pbs进行清洗(15分钟×2次)，并分别进行以20％ dmso/乙醇、80％乙醇、50％乙醇处理15分钟的透过处理。进而，使用抗谷氨酰胺合成酶(gs)抗体(abcam，ab73593)、抗e-钙粘蛋白抗体(abcam，ab76055)及与这些抗体结合的荧光标记二抗(novex donkey anti-mouse igg(h+l)secondary antibody、novex donkey anti-rabbit igg(h+l)secondary antibody(invitrogen))及核染色试剂(dapi)进行免疫染色，并利visikol histo-m(visikol inc.)进行透明化处理。通过lsm880共聚焦激光显微镜(zeiss)实施所得到的染色检体的荧光图像观察，得到荧光观察图像。将结果示于图5。