目的：检查人胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）组织和细胞系中ZBTB3的表达，并探讨ZBTB3对GBM细胞增殖和克隆形成的影响及其调控机制。方法：通过GEPIA2数据库分析GBM患者肿瘤组织中ZBTB3的表达情况。RT-PCR、qPCR和 Western blot 检测 GBM 细胞系（U251、U373、U87）中 ZBTB3 的 mRNA 和蛋白表达水平，筛选出 ZBTB3 表达最高的 U87 细胞。 CCK-8和克隆形成实验检测沉默ZBTB3基因对U87细胞增殖和克隆形成的影响。用p38MAPK、AMPK、Akt1抑制剂处理U87 细胞后，Western blot检测p38MAPK、AMPK、Akt1的磷酸化水平，RT-PCR、qPCR和Western blot测定ZBTB3的mRNA和蛋白表达水平，CCK-8和克隆形成实验检测细胞增殖和克隆形成。结果：GBM 患者肿瘤组织中ZBTB3的表达显著高于正常组织。 U251、U373和U87细胞中均可见ZBTB3的表达，其中U87细胞表达最高。沉默ZBTB3基因能明显抑制U87细胞的增殖和克隆形成。抑制AMPK既能显著降低U87细胞ZBTB3的表达水平，又可明显减弱U87细胞增殖和克隆形成。结论：GBM组织和细胞系中ZBTB3的表达显著上调，GBM细胞中AMPK活化并上调ZBTB3基因的表达，促进GBM细胞的增殖和克隆形成。

Objective：This study aims to examine the expression of ZBTB3 in human glioblastoma（GBM）tissues and cell lines，and to explore the effects of ZBTB3 on the proliferation and clonal formation of GBM cells and their regulatory mechanism. Methods：The expression of ZBTB3 in tumor tissues of GBM patients was analyzed by GEPIA2 database. The mRNA and protein expression levels of ZBTB3 in GBM cell lines（U251，U373，U87）were detected by RT-PCR，qPCR and Western blot，and U87 cell line was identified with the highest expression of ZBTB3. CCK - 8 and clonal formation assay were used to examine the effects of silencing ZBTB3 on the proliferation and clonal formation of U87 cells. U87 cells were treated with p38MAPK，AMPK and Akt1 inhibitors，and the phosphorylation levels of p38MAPK，AMPK and Akt1 were detected by Western blot. ZBTB3 mRNA and protein levels were detected by RT - PCR，qPCR and Western blot. Cell proliferation and clone formation were examined by CCK - 8 and clone formation assay. Results：The expression of ZBTB3 in tumor tissues of GBM patients was significantly higher than that in normal tissues. The expression levels of ZBTB3 in U251，U373 and U87 cell lines were examined，and the highest expression in U87 cells was observed. Silencing ZBTB3 markedly inhibited the proliferation and clonal formation of U87 cells. AMPK inhibition could not only obviously reduce the expression level of ZBTB3 in U87 cells，but also markedly attenuate the proliferation and clonal formation of U87 cells. Conclusion：The expression of ZBTB3 is obviously increased in GBM tissues and cells，and the AMPK - up - regulated ZBTB3 expression promotes the proliferation and clonal formation of GBM cells.

胶质母细胞瘤 ； ZBTB3 ； AMPK ； 增殖 ； 克隆形成

glioblastoma ； ZBTB3 ； AMPK ； proliferation ； clone formation

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，约占恶性脑肿瘤的 80%，主要起源于大脑的神经胶质细胞[1-2]。世界卫生组织根据病理学将胶质瘤分为Ⅰ~Ⅳ级。Ⅰ~Ⅱ级属于低级别胶质瘤，Ⅰ级主要是毛细胞型星形胶质瘤，Ⅱ级包括弥漫性星形细胞瘤、少突胶质瘤；Ⅲ~Ⅳ级属于高级别胶质瘤，其中Ⅲ级为间变性胶质瘤，Ⅳ级为胶质母细胞瘤（glioblastoma， GBM），是恶性程度最高的胶质瘤[3]。胶质瘤具有显著增殖和侵袭生长的能力，并最终形成颅内占位性病变，导致患者死亡。目前针对胶质瘤的治疗主要是手术切除，并辅以放疗和化疗，但患者5年生存率依然很低，尤其是 GBM 患者的平均生存时间不足 2 年[4-5]。因此探究GBM的发病机制或将有利于寻找新的干预方法。

锌指和 BTB 结构域蛋白 3（zinc finger and BTB domain containing3，ZBTB3）属于ZBTB家族成员，是一种转录因子，其蛋白包含 1 个锌指结构域和 1 个 BTB结构域，其锌指结构域通过与DNA特定元件结合，启动靶基因转录，而 BTB 结构域则可与其他转录调节因子相互作用，介导染色质重塑和基因激活[6]。研究表明，ZBTB3高表达可促进黑色素瘤、肺癌和乳腺癌细胞增殖，其分子机制涉及ZBTB3抑制 caspase⁃9、caspase⁃3 蛋白活化和 ROS 生成[7]。有文献报道，ZBTB3 可上调音猬因子（Sonic hedgehog， SHH）表达，诱发子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭[8]。提示，ZBTB3高表达能促进某些肿瘤的发生和发展。但有关GBM组织和细胞中ZBTB3表达及其对GBM的影响，目前尚不知晓。故本研究拟检测人GBM组织和细胞系中ZBTB3的表达情况，并探讨其对GBM细胞增殖的影响。

众所周知，在真核细胞中，基因表达会受到某些上游信号分子的调控，肿瘤细胞亦是如此，如 AMP 活化蛋白激酶（AMP ⁃activated protein kinase， AMPK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen⁃acti⁃ vated protein kinase，p38MAPK）、磷酸肌醇 3⁃激酶 （PI3K）/Akt1 等均可调控肿瘤细胞基因表达[9-10]。 AMPK 通过上调糖酵解和血管生成相关基因（如 GLUT1 和 VEGF）的表达以及诱导上皮间质转化 （epithelial mesenchymal transformation，EMT），促进肺癌和胰腺癌细胞的增殖或转移[11-12]。AMPK也可促进肾癌细胞增殖，其机制涉及 AMPK 募集 PKM2 和β⁃Catenin 形成复合物，促进细胞增殖相关基因 （CCND1 和 c⁃Myc）的表达[13]。而 p38MAPK 能增加 ZEB1和FOXC1基因的表达，从而促进GBM或结直肠癌细胞的侵袭和转移[14-15]。此外，Akt1 能上调 BCL⁃2基因表达或促进NF⁃κB活化，进而增加乳腺癌或GBM细胞的增殖水平[16-17]。综上所述，AMPK、 p38MAPK 和 Akt1 均能促进下游基因的表达，参与肿瘤病变，但有关AMPK、p38 MAPK及Akt1能否通过上调ZBTB3基因的表达促进GBM细胞增殖，目前尚不清楚。

抗总p38MAPK（t⁃p38MAPK）、磷酸化p38MAPK （p⁃p38MAPK）、总 AMPK（t⁃AMPK）、磷酸化 AMPK （p⁃AMPK）、总 Akt1（t⁃Akt1）、磷酸化 Akt1（p⁃Akt1， Ser473）抗体（Cell Signaling Technology公司，美国）； 抗 ZBTB3 抗体（成都正能生物公司）；β⁃actin 抗体 （Affinity 公司，美国）；HRP标记的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗（Biosharp 公司，美国）。CCK⁃8 试剂盒、 Perifosine（Akt1 抑制剂）、SB203580（p38 抑制剂）和 Compound C（AMPK抑制剂）（MCE公司，美国）。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Wisent 公司，美国），DMEM培养基（Gibco公司，美国）。35 mm细胞培养皿（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）。人 GBM 细胞系（U87、U373、U251）购自中科院上海细胞库。

将 U87、U373、U251 细胞接种于 3 mL 含 10% FBS 的 DMEM 完全培养液中，置于 37℃、5%CO2孵箱中培养2 d。当细胞融合度为90%左右时，用1 mL 胰蛋白酶消化细胞，离心后重悬细胞，按1∶3比例接种于新的细胞培养皿中，进行传代，并继续置于孵箱中培养。

反转录 PCR（reverse transcription ⁃ PCR，RT ⁃PCR）：通过NCBI数据库查找人ZBTB3和GAPDH基因CDS序列，并使用Primer Premier 5软件设计PCR 引物，由通用生物系统有限公司合成。引物序列如下：ZBTB3上游5′⁃CCACTGGTGGGGACCTTTTT ⁃3′，下游5′⁃AGCAGAGCCTTTCCATTCCC ⁃3′；GAPDH 上游5′⁃CAAGGTCATCCATGACAACTTTG⁃3′，下游5′⁃ GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG ⁃ 3′。提取细胞总 RNA，逆转录为 cDNA，以 cDNA 为模板，用 Prime⁃ STAR@ Max DNA Polymerase 对 cDNA 进行 PCR 扩增反应，PCR 产物用 1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳 （120 V，30 min），成像观察。使用 Quantity One 软件对电泳条带进行灰度扫描，同时行半定量分析。

实时定量PCR（quantitativereal⁃time PCR，qPCR）：通过NCBI数据库查找人ZBTB3和β⁃actin基因CDS 序列，并使用 Primer Premier 5 软件设计 PCR 引物，由通用生物系统有限公司合成。引物序列如下： ZBTB3上游5′⁃TCCTTCGTGGGGTACTATGGA⁃3′，下游 5′⁃CCAATTCCCGCTCCTTGTAGAA⁃3′；β⁃actin 上游5′⁃CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG⁃3′，下游5′ ⁃AGGTCCAGACGCAGGATGGCATG ⁃3′。每个样本设置3个复孔，反应条件：使用ABI Step One Plus实时定量 PCR 仪进行扩增反应。①保温阶段：95℃ 5 min；②循环阶段：95℃ 10 s，60℃ 30 s，共 40 个循环；③熔解曲线阶段：95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s。实验数据处理时，以β⁃actin作为内参，计算公式为2-ΔΔCT。

Western blot：将细胞裂解物煮沸后离心取上清，用10%预制混胶行SDS⁃PAGE电泳，先用50 V恒压浓缩，再用 120 V 恒压电泳分离 2 h，接着用 0.3A 湿转2 h，待蛋白转印到PVDF膜上后，再用5%脱脂奶粉室温封闭 2 h，加入抗 ZBTB3 抗体 4℃孵育过夜，1×TBST洗涤3次，每次30 min，再用HRP标记的二抗室温孵育 40 min，洗涤 3 次后行 ECL 化学发光试剂检测。使用Quantity One软件对电泳条带进行灰度扫描，同时行半定量分析。

取1.5 mL EP管，加入6 μL Lipofectamine2000和 94 μL无血清DMEM，吹打混匀，静置5 min；另取1个 1.5 mL EP管，加入2 μg质粒，再加入无血清DMEM至 100 μL；DMEM稀释后的Lipofectamine2000加入质粒中，吹打混匀，静置15 min；弃去细胞培养皿中的 DMEM，用 PBS 清洗，加入 1.8 mL 无血清 DMEM，将静置后的 Lipofectamine2000 和质粒混合溶液缓慢旋转加入细胞培养皿中。

由南京科瑞斯生物科技有限公司设计并合成 3 个针对ZBTB3基因不同靶点的shRNA质粒，分别命名为 shZBTB3⁃1、shZBTB3⁃2 和 shZBTB3⁃3，并进行了 DNA 测序鉴定。靶点序列 shZBTB3 ⁃ 1：5′ ⁃ GCTTCTGGACTTTATGTATGC ⁃ 3′；shZBTB3 ⁃ 2：5′ ⁃ GGAAACCAACTCACAGCTTCC ⁃3′；shZBTB3⁃3：5′ ⁃ GCATCTCAGCAGTTTCATTGG ⁃3′。同时构建对照 shRNA 质粒（shCTR）。将 shCTR、shZBTB3 ⁃ 1、 shZBTB3⁃2和shZBTB3⁃3分别转染U87细胞48 h，并收集RNA 和蛋白，行RT⁃PCR、qPCR 和Western blot 筛选最佳沉默靶点，方法同前。

无血清培养 U87 细胞 12 h，再用 10 μmol/L 的 SB203580、Compound C 和Perifosine 分别处理细胞，收取蛋白样，用Western blot检测p38MAPK、AMPK、 Akt1的磷酸化水平，方法同前。

U87细胞接种于96孔板，同时转染各shRNA质粒，培养48 h，每孔替换100 μL 10%的CCK⁃8溶液，放置培养箱避光孵育30~50 min，酶标仪测定450 nm 处的吸光度值。

U87细胞接种于35 mm细胞培养皿中（300个/皿），放置培养箱孵育 2 周，每隔 2 d 换 1 次液。弃上清液，用 PBS 洗 3 次，加甲醇固定 15 min。去除甲醇， PBS洗3次，加入2 mL结晶紫染液孵育30 min，PBS洗 3次，空气干燥。当细胞克隆直径≥0.75 mm时，记为阳性。

采用 SPSS 19.0 软件进行统计学分析，使用 GraphPad Prism 5.01软件进行绘图。所有实验均独立重复3次，所得定量数据以均数±标准误（x-±sx-）进行统计描述。多组间比较采用单因素方差分析， Bonfferoni 法进行两两比较；两组间差异比较采用 t 检验，P