（一）胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司 Gel Extraction Kit为例）

1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。 2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。近似地确定其体积（假设其密度为1g/ml）。加入等体积的Binding Buffer（XP2），于55-65℃水浴中温浴7min或至凝胶完全融化，每2-3 min振荡混合物。（在凝胶完全溶解之后，注意凝胶-Binding buffer混和物的pH值。如果其pH值大于8的话，DNA的产量将大大减少。如果是橙色或红色，则要加入5μl 浓度为5 M，pH为5.2的醋酸钠，以调低其pH值。该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。） 3.取一个干净的HiBind DNA Mini柱子装在一个干凈的2ml收集管内（已备好）。 4.将第三步获得的DNA/熔胶液全部转移至柱子中。室温下10,000 x g离心1分钟。弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。 5.如果DNA/凝胶熔液的体积超过700ul，一次只能转移700ul至柱子中，余下的可继续重复第5步至所有的溶液都经过柱子。每一个Hibind DNA回收纯化柱都有一个极限为25μg DNA的吸附能力。如果预期产量较大，则把样品分别加到合适数目的柱子中。 6.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。转移300μl Binding Buffer（XP2）至柱子中，室温下， 10,000 x g下离心1min。 7.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。转移700μl SPW Wash buffer（已用无水乙醇稀释的）至柱子中。室温下10,000xg离心1min。（浓缩的SPW Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。如果DNA洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下）。 8.重复用700μl SPW Wash buffer洗涤柱子。室温下10,000xg离心1min。 9.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。室温下,13,000 x g离心2 min以甩干柱子基质残余的液体。 10.把柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上，加入15~30μl（具体取决于预期的终产物浓度）的Elution Buffer(或TE缓冲液)到柱基质上，室温放置1min, 13,000xg离心1min以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出70-80%的结合DNA。 如果再洗脱一次的话，可以把残余的DNA洗脱出来，不过那样的浓度就会较低。

（二）连接反应（以Takara公司pMDTM18-T Simple Vector Kit为例）

1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 μl。 pMDTM18-T Simple Vector 1 μl Insert DNA 0.1 pmol～0.3 pmol dH2Oup to 5 μl 2）加入5 μl（等量）的 Solution I。 3）16℃反应30分钟。（2 kbp以上长片段PCR产物进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时）。 4）全量（10 μl）加入至100 μl 感受态细胞中，冰中放置30分钟。 5）42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 6）加入890 μl LB培养基，37℃振荡培养60分钟。 7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，鉴定载体中插入片段的长度大小。