DNA甲基化是基因表观遗传学的重要机制之一，参与调控基因表达和细胞分化的过程。在植物和哺乳动物中胞嘧啶残基第5位碳原子上的甲基化现象是研究最广泛的表观遗传修饰。在哺乳动物中, DNA的甲基化修饰主要发生在CpG岛（即富含CpG双核苷酸的300～3000bp的DNA片段），40%的基因启动子区都含CpG岛。而植物中除了CG甲基化外, 还有CHG和CHH的甲基化(H = A, C 或 T), 拟南芥(Arabidopsis thaliana)中CG、CHG和CHH的甲基化程度分别为24%、6.7%和1.7%。

DNA甲基化功能的本质是甲基化机制的建立、维持和去除甲基。DNA甲基化是通过DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)将甲基从S-腺苷蛋氨酸转移到胞嘧啶的5位来完成的。在哺乳动物中DNMTs有DNMT1、DNMT2和DNMT3三种, DNMT1负责完成复制后新合成链的甲基化来维持DNA的甲基化水平，在胚胎和成体中均有表达，但不能起始甲基化。虽然DNMT2具有甲基转移活性所需的基序，但到目前为止尚未发现其在体内具有甲基转移活性。DNMT3分为DNMT3a和DNMT3b, 主要在胚胎和胚胎干细胞(embryonic stem cells) 中有较高的活性，参与DNA的重新甲基化过程，是发育早期DNA甲基化必不可少的。目前，普遍认为DNMT3a对DNA甲基化的保持是必需的。在拟南芥中, 存在两种从头开始的DNA甲基化酶METHYLTRANSFERASE(MET1)和CHROMOMETHYLASE(CMT3),MET1是 DNMT1甲基化酶的同系物, 催化CG位点甲基化, 而CMT3是一个植物特异性的甲基化酶，催化CHG位点的甲基化。不对称的CHH位点的甲基化则由CMT3和DOMAINS REARRANGEDMETHYLTRANSFERASE 2(DRM2)共同催化, 在这个过程中可能涉及到一些 siRNA(Small interferingRNAs)或信号分子的作用。 

真核细胞内甲基化状态有3种：持续的低甲基化状态（如持家基因的甲基化）、诱导的去甲基化状态（如一些发育阶段特异性基因的修饰）和高度甲基化状态（如人类女性细胞内缢缩-失活的X染色体的甲基化）。

1.2.1 DNA甲基化与遗传物质的稳定性

研究证明，细菌DNA复制起始与DNA甲基化及DNA与细菌质膜的相互作用有关，DNA甲基化作为一种标签决定了复制起始点，控制了复制起始，使得DNA复制与细胞分裂保持一致；DNA错配修复是细胞增殖过程中纠正DNA复制错误的重要手段。复制后双链DNA在短期内（数分钟）保持半甲基化状态，错配修复系统从而能够区分旧链与新链，为新链中掺入的错误碱基提供了分子标记。

1.2.2 DNA甲基化与基因表达调控

DNA甲基化为非编码区（如内含子等）的长期沉默提供了一种有效的抑制机制。基因启动区域内CpG位点的甲基化通过三种方式影响基因转录活性：DNA序列甲基化直接阻碍转录因子的结合；甲基CpG结合蛋白结合到甲基化CpG位点与其他转录抑制因子相互作用；染色质结构的凝集阻碍了转录因子与其调控序列的结合。

1.2.3 DNA甲基化与胚胎发育

在胚胎发育的过程中，基因组范围内的DNA甲基化水平会发生剧烈的改变，其中，改变尤为剧烈的是配子形成期与早期胚胎发育阶段。错误甲基化模式的建立可能会引起人类疾病，如脆性X染色体综合征。

1.2.4 DNA甲基化与肿瘤发生

甲基化涉及到遗传物质稳定、基因表达调控、X染色体失活、转座子沉默、组蛋白修饰等多个方面。在脊椎动物如人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)中, DNA甲基化对维持正常的胚胎发育是必须的, 甲基化异常常常引起疾病的发生，DNA甲基化与癌症的发生发展有着密切的联系。DNA的甲基化改变包括高甲基化(hypermethylation)和低甲基化(hypomethylation)两种状态。一般来说，基因启动子区的DNA高甲基化意味着基因的沉默，而低甲基化意味着基因激活。对不同肿瘤细胞的DNA分析表明，癌变细胞中出现基因突变的概率要远远低于预期。而在转录组范围内检测结肠直肠癌中由启动子高甲基化引起的基因表达抑制，发现高达5%的已知基因在肿瘤细胞中发生了异常的启动子高甲基化。因此可以推测，与基因突变相比，DNA甲基化改变在细胞恶变过程中可能发挥了更大的作用。

① 直接抑制

CpG岛甲基化直接干扰tf与调控区DNA的结合。例如camp反应元件结合蛋白(creb)，ap-2，e2f，nfkb等tf不能与相应的DNA位点相结合。但有些tf如sp1，ctf与甲基化和非甲基化位点都能结合，这表明甲基化单独不足以阻止体内tf与DNA相结合。

② 间接抑制

近年来发现一些甲基化DNA结合蛋白如mdbp1，mdbp2以及甲基化CpG结合蛋白如mecp1，mecp2与甲基化DNA特异结合，抑制基因转录。其介导转录抑制的程度取决于甲基化密度和启动子的强度。如低密度甲基化可完全抑制一些弱的启动子，但对强的启动子则收效甚微。

③ 影响染色体结构

DNA甲基化还可通过影响染色体结构来抑制转录。不仅甲基化启动子区形成的核小体抑制体外起始转录，而且mecp1与甲基化启动子CpG位点结合后，可引起染色质聚缩成非活性高级结构，以至于转录因子不能与其相结合，从而抑制转录。DNA甲基化状态并非固定不变。在许多哺乳动物组织内，基因组甲基脱氧胞嘧啶水平随老化而下降，在鲑鱼、小鼠、大鼠、牛与人类的脑、肝脏、大肠粘膜、心脏和脾脏内发现DNA脱甲基化作用。相反，大鼠肺则不发生脱甲基化，大鼠肾内甲基脱氧胞苷总含量增加。这说明甲基化状态随老化而变化，即发生甲基化和脱甲基化，但总的说来，更常见的变化似乎是进行性的脱甲基化。这些变化均可导致随老化而发生的基因表达变化。

（1）在受精之前，精子和卵细胞中的DNA甲基化程度都很高；而在受精之后，父母的表观遗传记忆都被大规模擦除，到植入前的囊胚阶段，胚胎的DNA甲基化水平降到低点。但是在这一全基因组范围的DNA去甲基化过程中，标记着印记基因的DNA甲基化得以精确维持和保留。

（2）在受精之前，精子基因组DNA甲基化程度显著高于卵细胞，而在受精之后来自精子的父源DNA去甲基化的速度快于来自卵细胞的母源DNA。到受精卵晚期，父源DNA甲基化程度已经低于母源DNA的甲基化程度。

（3）受精卵基因组DNA去甲基化过程呈现强烈的异质性，在相同发育阶段的不同受精卵中，基因组DNA的甲基化程度有显著差异。

（4）在人类早期胚胎DNA甲基化组的大规模去甲基化过程中，相比于进化上更年轻、更活跃的转座子，进化上更古老的转座子重复序列上的DNA去甲基化程度更彻底，说明人类早期胚胎在植入前的发育过程中巧妙地在擦去表观遗传记忆和抑制转座子重复序列的转座活性之间取得了平衡。

（5）在人类卵母细胞中的非CpG位点上存在相对较高的DNA甲基化修饰，基因区的非CpG位点的甲基化程度跟相应基因的表达成正相关关系，说明非CpG位点的甲基化可能参与调控基因转录。

对于多数脊椎动物的组织，其基因组中总甲基胞嘧啶的含量随衰老而倾向于减少，从而引起基因组中低甲基化。主要由于：

1.5.1 DNA甲基化外源性调节与衰老

外源性因素，如与衰老相关的营养因素参与了DNA 低甲基化。食物甲基化供体摄入的不足有可能导致某些基因启动子发生去甲基化，而这些标记的改变可能会导致病理情况的发生和发展，如肥胖、2 型糖尿病、癌症、心血管系统疾病、神经退行性疾病和免疫性疾病等一系列老年性疾病。此外，食物中微量元素的不足也会影响DNA 的甲基化。在老年人中，微量元素锌、硒等的缺乏会导致一碳代谢的改变，从而也会引起基因组DNA 的低甲基化。

1.5.2 DNA甲基化内源性调节与衰老

DNA甲基化的内源性调节因素主要指机体内DNA 甲基转移酶和去甲基化酶的活性水平和体内其他因素对DNA 甲基化水平的调节。

(1) DNA甲基化酶活性改变

随着年龄的增加，对于保持异染色质DNA 超甲基化状态起重要作用的Dnmt1 活性逐渐降低，引起被动去甲基化，进而引起在衰老过程中，基因组的DNA 甲基化被逐渐消耗。从出生到衰老的过程中，Dnmt1 的表达量显著减少，并且Dnmt1 的活性降低可能导致在有丝分裂过程中甲基化模式复制减少。

(2) 叶酸代谢的障碍

随着年龄的增加，作为甲基供体之一的叶酸的摄入及其可利用率降低，叶酸也逐渐减少。衰老时由叶酸调节一碳代谢通路中的高半胱氨酸含量增加。而一碳代谢中甲基转移的紊乱是引起血液中高同型半胱氨酸增加的一个主要原因，这也同时增加细胞的S- 腺苷高半胱氨酸，进而抑制DNA 甲基转移酶活性，导致基因组低DNA 甲基化状态。

(3) 激素水平的改变

随着年龄的增大，动物机体内的激素水平也相应地发生一系列的变化。这些激素对于基因组的DNA 甲基化状态也产生了一定的影响。随着年龄的增加，性激素的减少可能会引起低DNA 甲基化。

1.5.3 甲基化与X染色体失活

哺乳动物中GpC岛胞嘧啶的甲基化与X染色体失活密切相关,若GpC岛甲基化缺失,X染色体失活状态将不稳定。雌性体细胞内存在两条X染色体, 而在雄性体细胞内只存在一条X染色体, 这就要求必须对不同数量的X染色体进行剂量补偿,使雌性个体中的一条X染色体失活。X染色体失活一旦建立则保持稳定,其所有的子细胞均失活同一条X染色体。

当一个卵子与精子形成一个雌性胚胎时，X特异性失活转录本(Xinactive-specifictranscript,xist)可以通过甲基化使来自于父方的那条染色体失活。xist基因5′端在活性的X染色体中是完全甲基化的, 而在失活的X染色体上则是非甲基化的, 也就是说xist基因是在失活X染色体上转录而在活性X染色体上不转录的唯一基因, 即xist基因的甲基化是相应染色体保持活性的保证。

全基因组DNA甲基化测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）是DNA甲基化研究的金标准。首先通过重亚硫酸盐对样本DNA进行处理，将未甲基化的C碱基转化为U碱基，而甲基化的C碱基则不会变，进行PCR扩增后，U碱基会变成T碱基，与原本甲基化的C碱基区分开，再结合高通量测序技术，对整个基因组上的甲基化情况进行分析，具有单碱基分辨率，可精确评估单个C碱基的甲基化水平。WGBS满足全基因组DNA甲基化图谱、疾病关联分析、基因调控分析、疾病的甲基化标志物筛选等探索性课题的研究。技术路线如下：

技术优势：

l 可精确分析每一个C碱基的甲基化状态

l 确定新的表观遗传标记和疾病靶标

l 可在全基因组水平上最大限度获取完整的甲基化信息，精确绘制全基因组甲基化图谱

l 适用于所有具有参考基因组的物种

l 性价比高，相对于传统BSP或MSP方法，费用较少

适用领域：

l 基因表达调控

l 发育表观组学

l 细胞分化、组织发育

简化甲基化测序 (Reduced Representation Bisulfite Sequencing, RRBS)是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，通过Msp I酶切（酶切位点为CCGG）富集启动子及CpG岛区域，并进行Bisulfite测序，用较小的数据量得到包含最多CpG位点甲基化信息的单碱基精度的甲基化图谱，同时实现DNA甲基化状态检测的高分辨率和测序数据的高利用率。作为一种高性价比的甲基化研究方法，简化甲基化测序在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。

该方法的覆盖范围具有良好的重复性和稳定性；并且能通过酶切位点过滤部分降解片段对结果的影响。但是RRBS的覆盖范围被酶切位点所限制，只能覆盖基因组的部分区域，主要集中在启动子区和CpG岛等富含CpG 的区域。在疾病研究中，启动子区的甲基化状态与基因表达、性状表型息息相关，RRBS作为一种关注CpG-rich区域的甲基化研究方法，能够避免过多的数据浪费，更有针对性的研究覆盖区域的甲基化状态，使得大样本量单碱基分辨率的甲基化差异研究成为可能。

技术路线如下：

技术优势：

l 可以确定甲基化位点，减少数据量，通量较高，单碱基分辨率

l 准确性高：数字化信号，直接测定每个转录本片段的序列

应用领域：

l 基因表达调控

l 发育表观组学

l 进化表观组学