CTC实验室检测技术与质量管理

CTC具有数量稀少［血液中CTC与有核细胞数量比值为1∶（105~107）］［64］、半衰期短（1~2.4 h）、存在多种亚型等特点，为CTC实验室检测带来了挑战。准确可靠的CTC检测结果需要系统性、标准化的质量管理体系来保障。本部分主要讨论CTC检测技术（分离与富集技术、鉴定与分析技术）的原理、特点及质量管理。

一、CTC检测技术

（一）CTC分离与富集

CTC检测的一般策略包括CTC分离与富集、鉴定及下游分析。CTC分离与富集是指将CTC与血细胞和其他血液成分有效分离的过程。文献报道及目前国内检测公司提供的技术平台很多，根据其技术原理主要分为依赖特定标志物的生物分选法和不依赖特定标志物的物理分离法两大类［65, 66］。生物学分选将特定标志物抗体或核酸适配体等附着至微柱、微孔或磁性设备，通过抗原抗体结合原理实现CTC分离与富集，可分为阳性富集和阴性富集两种。阳性富集法主要通过CTC捕获抗体正向富集CTC，该方法富集纯度较高，但由于CTC具有异质性，这类方法可能导致部分CTC的漏检，例如依赖EpCAM抗体磁珠的富集方法难以捕获EpCAM表达下调甚至消失（发生EMT时）的CTC亚群［67］。目前尚无普适性的肿瘤细胞标志物，因此难以避免CTC漏检现象。选择肿瘤类型特异的标志物抗体（如前列腺癌PSA、乳腺癌HER2、肺癌MUC1等）［65］或采用多种抗体复合物有助于提升富集效率［53］。阴性富集法主要采用CD45和CD61去除白细胞、巨噬细胞和血小板实现负向筛选，可降低CTC抗原表达下调或消失导致的检测假阴性风险［53］。但该方法分离纯度相对较低，对后续CTC鉴定与分析技术灵敏度和特异度的要求较高。

物理学分离方法是指通过CTC区别于其他细胞的物理学特征如大小、密度、力学及电学特征等进行CTC分离和富集。基于细胞大小分离是指根据CTC体积显著大于白细胞的特点、采用固定孔径的滤膜进行分离。密度梯度离心法根据CTC与白细胞密度及体积等沉降系数差异对CTC进行分离。电学特征分离法根据电荷、导电性等特征差异进行CTC分离与富集。微芯片法主要截留体积更大、不易变形的CTC，微流控法利用特定条件下不同细胞大小、密度、变形性等流体力学差异进行CTC富集。物理学分离的优势是不依赖特定标志物，有利于检出抗原表达异质型CTC和抗原未知的CTC亚型，但也可能存在分离纯度较低、容易漏检部分体积较小的肿瘤细胞等不足［65］。

不同技术方法各有其特点和局限性［65, 66］（表1），实验室应结合应用目的和后续鉴定与分析的要求选择合适的方法，例如小细胞肺癌CTC分析时避免选用常规的基于细胞大小分离的方法、当后续分析对细胞活性要求较高时避免选用需要固定细胞的富集方法等。也有技术同时结合生物分选和物理分离两种原理，以期提高CTC分离富集的效率和纯度，但同时可能带来处理时间延长、步骤繁多等问题，增大了其在临床实验室应用的难度，未来仍需发展更多简便、高效的CTC分离富集创新技术。

共识7：不同CTC分离与富集技术各有优缺点，实验室应结合应用目的和后续鉴定与分析的要求选择合适的方法；实验室应在充分评估所选方法的检测效能的基础上开展CTC分离与富集。

（二）CTC鉴定与分析

CTC鉴定是指通过分子生物学手段对富集的CTC进行特异性识别和判读，CTC分析则是进一步解析CTC的形态、功能、分子表达等特征。富集分离后可利用蛋白质、RNA、DNA表达差异以及肿瘤细胞功能差异对CTC进行鉴定与分析。

在蛋白层面主要利用适配体或抗体检测肿瘤细胞中的特异蛋白，如采用适配体技术和靶向PCR检测肿瘤细胞表面叶酸受体的表达可间接反映CTC的水平，具有高回收率和高敏感性的优势［21］，是国家药品监督管理局批准的首个肺癌CTC检测方法。免疫荧光法通常采用上皮细胞特异性CK抗体（CK8、CK18、CK19）、白细胞抗原CD45抗体和核染料DAPI标记CTC，CK阳性、DAPI阳性、CD45阴性，且细胞较大、形态完整的细胞被判别为CTC。但由于良性上皮细胞也可能呈CK阳性［68］，该方法可能出现假阳性结果。此外，EMT可引起抗原表达水平降低，使用单一抗体可能影响检测灵敏度。应根据癌症类型优化检测蛋白标志物的选择，同时采用阴阳性对照有利于提升免疫荧光法的检测特异性和灵敏度。流式细胞术则通过特异性抗体靶向肿瘤细胞进行快速检测，可同时实现多通道检测，但其灵敏度较低，且需要大量待分析细胞［69］。

在RNA层面可利用荧光定量PCR、RNA-荧光原位杂交等技术分析CTC的mRNA及微小RNA的表达。荧光定量PCR法是基于基因转录水平对细胞进行鉴定的方法，根据肿瘤类型选择不同核酸组合方式对多个基因标志物进行检测，可显著提高CTC的检测灵敏度［70］。在DNA层面上，不同于免疫荧光法易受CTC抗原表达量异质性的影响，基于染色体核型异常鉴定CTC的荧光原位杂交法可检出CK和EpCAM表达下调的CTC类型［71］，但需注意肿瘤细胞染色体拷贝数分布具有异质性，且良性血管内皮细胞也可能出现染色体核型异常，应根据癌症类型采用特定探针组合以提高检测准确性。也可利用靶向PCR、DNA测序等分析CTC的基因突变，如二代测序技术可检出未知突变；单细胞测序技术在克服CTC异质性方面有明显的优势，通过单细胞水平的CTC全基因组分析有助于揭示肿瘤转移及耐药的分子机制［72］。但CTC测序分析方法对设备及人员的要求较高，目前仍有待技术进一步完善以适应临床需求。

此外，一些基于肿瘤细胞功能学差异（分泌功能、代谢功能等）的新技术能够在不损伤CTC的情况下实现CTC的鉴定与分析。这类方法可避免由细胞固定、染色、杂交等处理导致的细胞结构及成分的破坏，可满足CTC下游分析和应用对细胞活性的要求，成为CTC检测分析的新方向。上皮免疫斑点法通过检测活的肿瘤细胞特异分泌的抗体或细胞因子，可在单细胞水平上检测有活性的CTC［73］。利用CTC线粒体活跃的特点设计聚集诱导发光荧光探针可标记代谢活跃的活性CTC，从而实现CTC的无损鉴定［74］。利用肿瘤细胞糖代谢特征（葡萄糖高摄取、关键代谢酶HK2活性高）可实现高通量的CTC鉴定与单细胞分析［75, 76］。利用针对CTC膜蛋白的抗体或适配体并结合可在温和的生理条件下运行的核酸等温扩增技术，可实现CTC的无损定量分析［77, 78］。但目前不同鉴定及分析方法的结果表述方式不尽相同，检测结果之间难以相互比较，实验室在开展检测前应进行充分的性能评估。

共识8：CTC鉴定与分析技术的选择应综合考虑上游分离富集技术的特点和下游应用的目的，根据肿瘤类型选择合适的标志物可提高CTC检测的准确性，结合细胞功能特征分析可丰富CTC检测的层次以适应临床诊疗的多种需求；实验室应在充分评估所选方法分析性能的基础上进行CTC鉴定与分析。

二、CTC实验室检测的质量管理

良好的质量控制（质控）是保障检测结果准确可靠的基础。CTC检测和分析具有重要的临床价值，如何完善CTC检测质控以确保CTC检测结果准确性是重大挑战。因此，亟需推进检测流程标准化、建立严格的质量管理体系，以规范CTC检测的临床应用与结果解读。

（一）分析系统性能验证

实验室对CTC检测过程中所需试剂和耗材的选择，应首先考虑经国家药品监督管理局医疗器械注册/备案的试剂与耗材，以确保符合临床要求；同时也应兼顾其与检测设备的兼容性，以确保符合检测要求。所选的分析系统使用前必须依照说明书完成相关的性能验证，验证参数（针对CTC分离与富集、鉴定及分析的检测全流程）包括但不限于回收率、检测限、精密度等，并制定标准实验操作流程（standard operation procedure，SOP），以减少不规范的实验操作对结果的影响。目前国内外尚无权威的CTC性能验证指南，本部分参考《CNAS-GL039分子诊断检验程序性能验证指南》［79］列举部分性能参数进行说明。

1. 回收率：通常可利用细胞掺入实验测定CTC分析系统的回收率及检测限［80, 81］。根据拟开展检测的肿瘤类型，选择适宜的肿瘤细胞系进行荧光预标记，计数一定数量的细胞（根据具体肿瘤类型和分析系统的检测范围确定）加入健康人静脉血作为模拟血样，重复检测3~5次，计算检测的细胞数占掺入细胞数的百分比即为回收率。

2. 检测限：将拟开展检测的肿瘤类型对应的肿瘤细胞系预标记荧光，制成系列浓度梯度（结合说明书提供的检测范围设定）的细胞悬液分别加入健康人静脉血作为模拟血样，通过检测的肿瘤细胞数量评估分析系统的检测范围和检测限。

3. 精密度：将开展检测的对应工具细胞预先染色，根据方法的检测范围制备已知数量（高、中、低浓度）的多份细胞悬液冻存。每次检测时取一份细胞悬液加入健康人静脉血中，制成高、中、低浓度的模拟血样，重复检测各浓度模拟血样10~20次，或连续检测各浓度模拟血样10~20 d，评估检测系统的批内和批间精密度。

分析系统的性能参数应达到厂家说明书提供的标准，根据文献报道和实验室调研，CTC分析性能验证时常用的肿瘤细胞系如表2所示，实验室应根据采用的检测技术和拟开展应用的肿瘤类型选择理化性质相似的细胞系进行性能验证。必要时（如涉及实验室自建方法或操作流程时）还应根据实验室自建项目的相关要求进行其他的性能参数确认（如标本稳定性、试剂稳定性等）［82］。根据CTC检测方法的不同特点可选择不同的性能验证或确认的参数，实验室可根据实际情况确定所需的最小样本数。

此外，实验室在引进性能验证合格的CTC分析系统后，还应在实际开展CTC检测项目之前进行临床应用前评估（如CTC检测在不同人群中的阳性率、CTC临床参考范围及截断值等）。由于各实验室使用的检测方法、拟开展的肿瘤类型及应用场景不尽相同，目前尚无法确定统一的CTC参考范围和截断值，建议实验室参考针对同方法、同癌种的大型临床研究报道的结果，并设计相关的临床试验确定本实验室适用的CTC参考范围和截断值。行业内专业委员会可制订相应的临床研究计划，推动各实验室开展大规模、多中心临床研究，以明确同一CTC检测方法在同一肿瘤特定场景应用的参考范围和最佳截断值。

共识9：实验室开展CTC检测前应对所选分析系统进行性能验证，属于实验室自建方法的分析系统还应根据相关要求进行其他参数的性能确认；应注意所选CTC分析系统的适用范围，跨癌种应用时应考虑到不同起源、不同病理类型肿瘤细胞的理化性质不尽相同，须进行充分的性能验证和临床观察研究。

（二）分析前质量管理

良好的分析前质量管理是保障检测结果准确的前提条件。CTC检测分析前质量管理主要涉及样本采集（患者准备、采集要求等）、预处理、保存和运输（时间和温度）等。分析前SOP应涵盖样本采集、预处理、保存和运输过程的系列标准操作，并对质控变量进行充分的说明和解释。

1.样本采集：CTC样本采集的质控变量应实现标准化，其内容应包括但不局限于：采血时间、是否禁食、采血时患者体位、采血管类型及抗凝物质要求、采血部位、采血量等［83］。常见的采血管类型包括EDTA-K2抗凝管、CellSave抗凝管、cfDNA/RNA保存BCT管、ACD采血管等，不同采血管对CTC保存的时效和稳定性不尽相同［84, 85］。有研究表明CellSave管用于CTC计数和染色分析时可使血液在室温下保存72~96 h［86］；CTC-ARV7转录物（数字PCR分析）在EDTA-K2或ACD抗凝血液中可稳定48 h，但BCT管中的mRNA在采血后显著降低且48 h后无法测出［87］。建议优先选择检测方法配套或推荐的采血管，无明确指定时可根据检测目的、检测时长和保存剂的特点进行选择，例如需要对CTC进行计数和形态分析时可选用常规EDTA-K2或CellSave管、需要进行CTC分子分析时可选用核酸保护效果较好的ACD管等［84, 85］。

外周静脉血是目前最常用的CTC检测样本类型，建议常规采集流程为：肘部静脉穿刺采集外周血5~20 ml（采血量视检测方法的要求而定）。采血后立即轻柔颠倒8~10次混匀，防止凝血。需注意的是循环系统中不同部位CTC之间存在明显的细胞分布和生物学特征的空间异质性。研究发现，从肝癌患者外周静脉、外周动脉、肝静脉、肝下下腔静脉和门静脉采血检测的CTC数量、EMT表型和CTC细胞团各有特点，且其在提示肝癌术后肺转移和肝内复发方面的临床价值也不尽相同［37］。临床医生可根据患者治疗周期、治疗方案、研究目的等实际情况选择相应的采血部位和采血时间点，但建议治疗或研究的全过程中样本采集条件相对固定，以便于后续结果的解释。

2.样本预处理、保存及运输：应采用标准化试剂盒对CTC样本进行预处理，并对样本预处理、保存和运输过程中质控变量的变异范围进行有效追踪和管理［85］。应严格按照相关操作规范执行操作，有效保障标本接收时的质量。一般建议血液采集完毕后立即送检，不能立即送检的标本应低温保存（2~8 ℃），4 h内转移至检测实验室进行检测。到达实验室后，应检查样本是否存在凝血、脂血等异常情况，对不合格样本应拒收，不能及时检测的样本应根据检测目的和采血管特点严格控制样本储存条件（时间、温度）。

（三）分析中的质量管理

分析中的质量管理是CTC实验室检测质控的核心环节。建议在CTC分离与富集、鉴定及分析的全过程均引入标准化检测设备和配套软件，并建立完善的标准操作程序和检测人员的资质管理制度，健全实验室质控体系，充分保障检测结果的准确性。

1.人员培训与考核：实验室应配置相关专业背景的技术人员，经理论和操作实践的培训与考核后方可开展CTC项目检测。操作人员严格遵循检验设备及试剂的质量管理体系是检测结果可靠准确的有效保障。应定期开展操作人员的项目操作技能考核，包括但不限于自动化检测设备的使用与维护、试剂与耗材的标准操作规范、质控相关标准操作步骤的实施等，其中不同操作人员间对CTC检测图像的判断可能存在较大差异，应定期根据典型和非典型CTC检测图谱开展人员能力比对，以提高检测结果准确性。另外，利用整合人工智能图像识别工具的全自动CTC分离及鉴定系统［88］有助于减少人员间的操作误差。

2. 试剂/耗材质检和设备维护：CTC检测步骤较多，应制定标准化程序对检测过程中涉及到的试剂和耗材进行质检，包括包装检查（包装是否完整、标识是否清楚、保存条件和有效期是否明确等）和可能影响检测结果的关键性能参数检查（依检测方法的原理和操作而定，例如荧光探针/抗体的有效性和批间一致性、滤膜的孔径大小和滤过效率、吸头的气密性/准确性/携带污染源等）。此外，使用过程中应定期监测和记录试剂/耗材的保存温度和有效期，并定期对所用的仪器设备做维护和保养以充分保障其性能稳定。

3.室内与室间质控：检验项目应设立合理的室内质控以监测样本检测的全部流程，但目前尚无公认适宜的CTC实验室检测全程质控物。考虑到不同CTC检测平台应用的仪器设备和试剂各异，应根据不同检测平台的关键步骤分别设立合理的质控或定期对使用的设备及试剂耗材进行性能评估。如分离富集CTC的过程中，对于微流控芯片法，应注意监控泵的流速控制和每批芯片的均一性；对于膜过滤法，应充分考虑到负压泵的稳定性、滤过膜孔径的大小和均一性等。CTC鉴定的过程中，应监控不同标记探针或抗体及杂交试剂的质量等。

虽然目前没有商品化的CTC检测全程质控品，但对有些步骤建议技术厂家也能提供适宜的参考品。例如预制备的肿瘤细胞与白细胞混合细胞甩片，可用于评估鉴定试剂性能及技术人员的图像识别能力。同时，行业内专业委员会可制定CTC检测参考物质的研发计划，联合相关企业积极推动CTC质控物的开发和商品化。例如，Tommasi团队的实验室利用肿瘤细胞系掺入健康人血样中构建不同浓度的参考品，在采用相同检测系统的多个实验室开展长期、系统的性能验证和评估后作为CTC室内质控品使用［81］。实验室质控品的构建应注意符合临床样本的模拟度（肿瘤细胞类型、大小及分子特性等），同时保证性能稳定且数量充足，以满足长时间检测分析的要求。质控品的制备建议由固定的专业人员，在固定的实验区域培养、配制和分装，以减少人为误差，避免受到临床样本的污染。

实验室可根据CTC检测项目和检测平台制定相应的可接受的质控标准。如果质控品的结果与预期不相符，需分析失控原因并保存相应记录，同时提出有效的纠正措施和预防措施。另外，基于患者的实时质量控制（patient-based real-time quality control，PBRTQC）可通过来自患者样本的数据，在日常检测的同时实时监测检测系统状态［89, 90］。浮动均值法是常用方法之一，通过定期对比患者CTC检测数据的均值与靶值及控制极限值的偏离情况，可有效辅助判断检验实验室的项目运行是否在控。各检测实验室可考虑根据积累的检测数据建立适用于本实验室CTC检测的PBRTQC方法，并作为实验室质控体系的一部分。

采用相同检测系统的实验室应定期开展室间质控活动，对相同的工具细胞系或同一患者来源的生物学标本开展检测对比。由于目前开展的CTC检测项目有限，实验室间质控更多采用实验室间比对及替代方法的方式解决。比对应至少每年1次，比对样品的数量至少3份，包括阴性、低浓度和高浓度水平。当实验室间比对无法开展时，可采用其他替代方法，如标本的盲法重检、与其他方法比较或临床相关性分析判断检测结果的可接受性。

（四）分析后的质量管理

分析后的质量管理是全程质控的最后一个环节，也是促进检验工作更好地服务临床的重要保障。CTC检测的分析后质量管理主要包括检测结果确认、报告发放，以及临床沟通和咨询服务。CTC检测结果确认应注意再次检查标本质量是否符合要求、检测过程中仪器设备是否运转正常、质控是否在可接受范围内、是否有干扰检测结果的因素、CTC结果与患者的临床病情或关联的检验参数之间是否存在不可解释的现象等。必要时应对异常结果或疑难结果复查之后才可发放结果。

CTC检测报告建议包含但不限于如下内容：患者一般信息、临床诊断、样本信息（采样部位、采样时间和检测时间）、方法学描述、CTC检测结果（包含但不限于细胞图像、细胞计数、分子分型、历史结果等）、必要的截断值、局限性说明等。建议采用同种检测方法的不同实验室发放CTC的报告内容保持一致，以增加实验室间结果的可比性。有效的报告解读与临床沟通是实现CTC临床应用的必要条件。CTC检测报告解读时应综合考虑分析前和分析中各个环节可能的影响因素，并紧密联系患者的临床病情；建议有条件的实验室可以在报告中同时纳入检验医师或临床医师对检测结果临床意义解读的指导性意见。临床沟通工作应对检测结果、质量体系、结果的临床符合性做充分说明，对临床应用中出现的疑难问题从方法性能和临床肿瘤学角度做好客观、详细的解释与沟通。

共识10：严格的质量管理是保证CTC检测结果准确、可靠的关键。实验室应针对CTC检测的各个关键环节，建立完善的质量管理体系以规范分析前、分析中及分析后的操作流程，并做好检测结果解读与临床沟通工作，以保障CTC临床应用的有效性及实用性。

CTC具有随血液循环播散至远处器官形成转移灶的潜力，在反映原发肿瘤特征和转移性疾病的发生发展方面有重要意义。CTC检测在肿瘤疗效评价、预后评估等方面有广阔的应用前景，临床医生在选择CTC检测项目时应注意明确其应用场景和适用范围，以确保CTC检测的合理应用。随着CTC检测从单纯计数进入分子分型和下游分析时代，进一步提高CTC检测的准确性并利用CTC监测转移启动、辅助临床治疗决策值得更多研究探索和应用实践。

CTC由多种细胞亚型组成，稀有性和异质性是CTC检测技术的挑战。标准化、准确、可靠是CTC检测技术的基本要求。提高检测技术的灵敏度和特异性、探索未知的CTC存在形式、分子分型和单细胞特征是CTC技术创新的重要方向。如何提高CTC检测流程的质量管理水平任重而道远。实验室应根据实际需求选择合适的检测技术，充分验证性能、建立标准检测流程、健全质量管理细节、提高CTC检测报告规范性，不断推进CTC的临床应用与发展。