对于分子生物学实验，逆转录主要用于生成代表组织或细胞特异性RNA群体的互补DNA（cDNA）。为使实验成功，需要考虑一些与模板、试剂和反应条件相关的关键注意事项。

Learn how reverse transcription works and how to select the right reverse transcriptases and primers for your experiment. 

RNA是逆转录的模板。总RNA通常用于RT-(q)PCR等下游应用的cDNA合成，而特定类型的RNA（例如，信使RNA（mRNA），miRNA等小RNA）可经过富集而用于某些应用，如cDNA文库构建和miRNA图谱分析。

维护RNA完整性至关重要，在提取、处理、储存和实验使用过程中需要采取特殊的保护措施。防止RNA降解的最佳方法包括佩戴手套、使用具有气溶胶屏障的移液管移液、使用无核酸酶的实验室器具和试剂以及对工作区域进行去污处理。

根据来源材料（如血液、组织、细胞、植物）的类型和实验目标，有多种RNA分离和纯化方法可供选择。分离工作流程的主要目标是稳定RNA分子、抑制RNA酶，并通过适当的储存和提取方法最大程度提高产量。最佳的纯化方法可以去除干扰酶活性的内源性化合物，如植物组织中的复合多糖和腐殖酸，以及逆转录酶的常见抑制剂，如盐、金属离子、乙醇和苯酚。纯化的RNA应保存在-80°C，尽量减少反复冻融。

Learn about reverse transcriptase inhibitors, their inhibitory mechanisms, and tips on overcoming inhibitors in reverse transcription.

纯化后评估RNA质量和数量的方法有许多种。常用的方法是利用紫外光谱法检测特定波长的吸光度。RNA质量可通过利用Beer-Lambert定律测定260 nm处的吸光度而确定；不同波长的吸光度比值可以确定是否存在特定污染物（表1）。请注意，紫外吸光度不是RNA特有的，所有核酸都可以吸收相近波长的紫外线。对于需要更高RNA特异和更灵敏分析的RNA, 可以考虑使用含染料的荧光试剂，这种试剂只在特异性的与目标分子结合时才会释放荧光信号。

Learn about determining sample purity by absorbance and calculating A260/A280 ratios.

表1. RNA分析的紫外检测指南

以28S和18S核糖体RNA（rRNA）的比值代表总RNA，可评估RNA的完整性。总RNA经过变性，并利用凝胶电泳按照分子量大小进行分离，可对其进行定性评估。然后，评估28S rRNA与18S rRNA的强度比，比值为2:1代表完整的RNA（图1A）。Agilent Technologies开发的一种方法结合了微流体学和专利算法，可定量评估RNA的完整性。该方法可产生数字读数，称为RNA完整性分数或RIN，数值介于8至10之间代表高质量的RNA [1,2]（图1B）。

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有些情况下，痕量基因组DNA（gDNA）可能与RNA共同被纯化。污染性gDNA可能会干扰逆转录，并导致RT-qPCR等灵敏性应用出现假阳性、高背景或检测率降低。

为去除gDNA，通常在RNA分离过程中加入DNase I。在进行RT-PCR之前，必须完全去除DNase I，因为任何残留的酶都会使单链DNA（如引物和合成cDNA）降解。通常，DNase I失活（如，EDTA和加热处理）或酶去除步骤会导致RNA降解或样品损失。

作为DNase I的替代品，可使用双链特异性Dnase去除污染性gDNA，而不影响RNA或单链DNA。它们的热分解性质使其在相对温和的温度（如55℃）下即可失活，同时没有负面影响。在逆转录反应之前，可以将这种双链特异性热分解DNase与RNA在37℃下孵育2分钟，从而简化工作流程（图2）。

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逆转录酶以RNA为模板合成互补DNA，但这一类逆转录酶可能具有不同的功能活性和性质。它们的性质会影响其逆转录长RNA转录物、富含GC的RNA、具有明显二级结构的RNA和次优质RNA的能力。

分子生物学中使用的大多数逆转录酶来源于禽成髓细胞瘤病毒（AMV）或莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）的pol基因。 AMV逆转录酶是实验室中首批用于cDNA合成的酶之一。该酶是一种分子量为170-kDa的异二聚体，最佳反应温度范围为42-48℃。 AMV逆转录酶具有较强的RNase H活性，可降解RNA:cDNA复合物中的RNA，产生较短的cDNA片段（