以生年班田物细胞的总 mRNA 扩破道气为模板，用反转录酶合成互补的双链 cDNA [1]，然后接到载体上，转入到宿主后建立的基因文库就是 cDNA 文库。

1、mRNA的提取及其完整性的确定

1) 总 RNA 的提取

RNA 提取方法:APGC法或NP-40或应用试剂盒提取总RNA

2)mRNA的分离

高等真核生物 mRNA 分子的 3' 端均抓轻企代有 poly(A) 尾，将总RNA通过寡聚(DT)纤维柱分离mRNA或利用磁珠法制备纯mRNA。在某些情况下，裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物作为提取mRNA的替换途径。

3) mRNA 的纯化 ①按照大小对总 mRNA 进行分级，主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级点被宣行析群细叶区考;②多聚核糖体的免疫学举弱高集见纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。

4)mRNA 岩列传足鱼立完整性的确定

确定 mRNA 完整性的方法有三种:

① 直接检测 mRNA 分子的大小;

② 测定 mRNA 的转译能力;

③ 检测总 mRNA 指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。

2、 cDNA 的合成和克隆

1) cDNA 第一链的合成

用亲和层析法得到 的mRNA 后，根据 mR各拉永斯陈几者评NA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理，用 12~20 个核苷酸长的 oligo ( dT )与纯化的 mRNA 混合， oligo ( dT )会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的相引较划还心几斗产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo ( dT )结合在 mRNA 的 3' 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是 mRNA 链很长时，为此建立了一种随机引物法合成 cDNA 。随机引物是一种长度为 6~10 个核苷酸，由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。与 oligo ( dT )仅与 mRNA 3' 端结合不同，它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链，即形成双链 DNA 分子。

2)边微滑. 双链 cDNA 的合成

合成 cDNA 第二条链有两种方法。一种方法是利用 cDNA 第一链的 3' 末端常常出现发众甚乐距停觉夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端"返折"并且进行复制第一链的结果，它为合成 cDNA 第二链提供鸡促权妈操了有用的引物。用这种方法合成的双链 cDNA 在一端有一个发夹环，可以用单链特异的 S1 核酸酶切去。但是 S1 核酸酶的处理，常常会"修剪 " 过空另多的 cDNA 顺序，使 cDNA 丢失了 mRNA 5' 端的部分顺序。 另一种方法是用大肠杆菌的 RNase H 进行修饰。 RNase H 缺济法今能识别 RNA-DNA 杂交分子并把其中的 脸船茶静信型美念洋RNA 切割成短的片段，这些 RNA 短片段仍与 cDNA 第一链结合，可被新合成的 D绿模宗新将NA 所取代。新合成的 DNA 存在切口，用 DNA 连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的 DNA 链。 RNase H 法优于 S1 核酸酶法，它能获得包括 mRNA 5' 端全部或绝大修饭部分的更长顺序 cDNA 分子。

3) 将 cDNA 重组到载体上 合成的 cDNA 与载体 DNA 进行连接一般有 3 种方法:

① 借助于末端转移酶的 3' -OH 端合成均聚物的能力，双链 cDNA 和线性化载体 DNA 的 3' -OH 端分别加上均聚核苷酸链;

② 双链 cDNA 和线性化载体 DNA 分别用 Klenow 片段进行末端补平，然后用 T4 DNA 连接酶进行齐头连接，形成重组体;

③ 通过粘性末端连写护是病银接。

4). 转化

重组的载体 D刘胞课过粮女争问受NA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。当不同重组的 DNA 含有不同的 cDNA 基因时，整个转化子含有来自 mRNA 群体宣歌令的各种 cDNA 基因，这样的转 化子群体构思报界积破表强蛋杂烈成该 mRNA 全部遗传信息的 cDNA 基因文库。

5). 目的 cDNA 岩稳吗零克隆的鉴定

用于从 cDNA 文库中筛选和鉴定目的 cDN何美松衡垂星春A 的方法主要有 3 种:

① 核酸杂交 ②免疫学杂交检测 ③ 达件组企打任cDNA 同胞选择