与DiOC6相似，罗丹明123（Rh123）最初用于不少研究，不过Rh123虽然容易进入细胞并迅速达到平衡，但不能很好地保留在里面。此外，在某些情况下，Rh123与线粒体的结合可能与线粒体能量状态无关，这进一步限制了其使用。

四甲基若丹明乙酯（TMRE）和四甲基若丹明甲酯（TMRM）也被广泛用于流式细胞术检测mtmP，这些染料无毒，染色后不易淬灭，但应以相对较低的浓度使用，可以在染色后立即进行分析，无需洗涤。这两种染料激发光均为488nm，发射波长574nm发射。通常，应准备未染色的样品（也称为“空白样品”），以设置背景荧光的水平。因此，通过TMRE或TMRM分析mtmP的变化时，就被定义为给定样品的MdFI的变化。

碳花青染料，尤其是JC-1被认为是检测mtmP的最可靠探针。JC-1具有多色荧光发射光谱，并允许对mt去极化进行比例式半定量评估。在单体状态下，它发出绿色荧光（529 nm），而在高度依赖于mtmP的聚集状态下，它发出橙红色荧光（> 590 nm），在化合物诱导mtmP崩溃时，JC-1也会成为单体。这意味着，在健康细胞中，可以出现少量绿色，大多数为橙红色荧光，线粒体去极化的细胞大多仅显示绿色荧光。考虑到由于mtmP变化引起的荧光变化，显示结果的最佳方法是指示mtmP高或低的细胞百分比，而不是绿色和橙红色荧光之间的比率。

自1993年以来，据报道，JC-1是几种细胞类型和测定条件的可靠膜电位指示剂，并且其与其他荧光探针的兼容性也已在多色方案中得到了证明。但是，JC-1对过氧化氢敏感、光敏感以及单体与聚集体形式之间的平衡速度较慢，可能会在一定程度上限制其使用。其它类似于JC-1的还有JC-9和JC-10，JC-9的单体或聚集体形式在522 nm激发，分别以535或635 nm发射。JC-10在490 nm激发，并在520 nm（单体形式）或590 nm（聚集形式）发射。

线粒体质量检测染料

线粒体质量可通过使用能够结合特定mt成分的染料进行监测，而与mt极化状态无关。因此，荧光量与mt含量成正比。Mito ID和nonyl acridine orange（NAO）这两种染料能与mt内膜的cardiolipin结合，而MitoTracker染料与mt蛋白中存在的半胱氨酸残基的巯基反应。其中一些染料，包括MitoTracker deep red 633，也与mt蛋白形成共价键，因此在细胞染色后可以固定。与TMRE和TMRM类似的是，对于MitoTracker染料，应测量MdFI的变化。

线粒体ROS检测染料

关于mt ROS，最近开发了两种荧光探针，分别是MitoSOX和mitoPY1，以分别标记线粒体中的阴离子超氧化物和过氧化氢。

MitoSOX是氢乙啶化合物，可靶向定位到线粒体，依赖mtmP积累到线粒体中，氧化后与线粒体DNA结合后发出荧光。与其他探针类似，当使用MitoSOX和mitoPY1时，必须准备足够的阳性和阴性对照全面验证生物系统中mt H2O2的存在。Antimycin A或阿霉素是MitoSOX染色的最佳阳性对照，而外源H2O2则是mitoPY1的正确阳性对照。MitoSOX染色的阴性对照是细胞可渗透的超氧化物歧化酶模拟物或mt解偶联剂，具体取决于细胞类型。对照的其它制备形式也可以用抗氧化剂来处理，例如N-乙酰半胱氨酸或其他能大大减少自由基产生的特异性清除剂。

目前已有不少文献通过流式细胞术对MitoSOX和mitoPY1进行了测试，能选择性定量角质形成细胞、内皮细胞、成纤维细胞和几种癌细胞系中的mt阴离子超氧化物和mt过氧化氢，也有报道可能在同一细胞中同时使用MitoSOX和mitoPY1来分析活细胞中的mt ROS。

编译自：Eur. J. Immunol. 2019. 49: 1526－1529

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