操作中的注意事项及解释

1. 

为提高分子间连接的效率

,

连接反应中

cDNA

的浓度要低

,

因为高浓度的

cDNA 

可能会提高非同源连接水平

,

从而产生非特异扩增

. 

2. 

成环的双链

cDNA

进行裂解和变性比较重要

,

因为环状双链

DNA

分子易于形

成超螺旋而不利于

PCR

反应

,

它只可以扩增出较短的

DNA

片段

. 

3. 

现认为下列方法可在成环的

DNA

分子中引入切割

: 

3.1 

最常用的简便办法是煮沸

,

但因为某些环状双链

DNA

分子不时形成不太普遍

的二级结构

,

使得该方法在使环状双链

DNA

分子变性和引入切刻时并不很奏效

. 

3.2 

第二种办法是选用核酸内切酶进行消化

,

理想的限制位点应位于已知序列内

,

但在多数情况下

,

由于

cDNA

未知已域内酶的限制图谱并不清楚

,

所以很难选择用

何种限制酶

. 

3.3 

如果没有合适的限制性酶可用

,

也可以尝试使用

EDTA-

寡核苷酸

-

介导的特异

裂解办法

.T

处连有

EDTA-Fe

的寡核苷酸通过与双链

DNA

形成三股螺旋而特异

地结合于双链

DNA

某一区段

,

这样就可以在结合位点裂解双链

DNA. 

4. 

碱变性法已成功地用于制备

PCR

和测序用质粒

DNA,

该方法也可以有效地使

环化的双链

cDNA

实现变性

. 

5. 

加入

T4 

RNA

连接酶或氯化六氨合高钴可以提高

T4 

DNA

连接酶催化的双链

DNA

平齐末端连接的效率