【实验技术笔记】细胞表型检测之细胞凋亡(Hoechst染色 + PI染色 + TUNEL 染色 + Annexin V |
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1. 细胞凋亡2. 检测细胞凋亡:Hoechst 染色3. 检测细胞凋亡:PI 染色4. 检测细胞凋亡:TUNEL 染色5. 检测细胞凋亡:Annexin V-PI 双染
1. 细胞凋亡
细胞要增殖分裂出新细胞需要经过完整的细胞周期,细胞周期中有 2 个关键的 check-point 细胞周期检验点: △ G1/S check-point:调控细胞从静止状态进入 DNA 合成期,防止有损伤或突变的细胞进入 S 期,并启动相应的信号通路进行损伤修复。 △ G2/M check-point:是决定细胞分裂的控制点。如果能够通过这个检查点,细胞内的染色体就能收缩,开始有丝分裂;如果不能通过,细胞就会暂停,启动 DNA 的损伤修复机制。如果 DNA 损伤修复机制仍然不能修复,细胞就会进入程序化的细胞凋亡路径。
细胞凋亡(Apoptosis)的过程 细胞凋亡:是细胞主动的,有步骤的死亡过程,不涉及炎症。细胞坏死:被动的,无序的死亡过程。在压力刺激下(紫外线、氧化剂、烷化剂、药物等),细胞的基因组 DNA 可能会发生损伤,如果损伤能被修复,就能继续行使功能;如果损伤不能被修复,细胞就无法进入正常的细胞周期,就会主动进入细胞凋亡过程。![]() Hoechst 染色检测细胞凋亡的原理 Hoechst 是一种蓝色荧光染料。有 3 种类似物,分别是 Hoechst 33258,Hoechst 33342 和 Hoechst 34580。 其中 Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 最常用,两者具有相同的激发光谱和发射光谱范围。Hoechst 33342 渗透性更好,更推荐。Hoechst 能穿过细胞膜与 DNA 双螺旋的小沟结合,尤其是富含 AT 的序列。 DAPI 也是染细胞核的蓝色染料,如果是染固定细胞,两者都可以,如果是染活细胞,建议用 Hoechst,因为 Hoechst 对细胞的毒性比 DAPI 小。Hoechst 33342 和 Hoechst 33258 都能用 350nm 的紫外光激发,最大发射光 461nm(蓝色)。正常细胞 基因组 DNA 分布均匀,Hoechst 染色后是比较均匀的蓝色,细胞核是圆圆的。分裂旺盛的细胞 具有比较大的核仁,在核仁的位置染不上 Hoechst,会出现黑色的空洞,核的边缘比较清晰,且形状比较规则的。凋亡细胞 由于核固缩、变形、碎裂,Hoechst 染色的核的形状变成月牙状或碎裂成几块,呈现出来的蓝色发白发亮。适用于检测培养的细胞和组织样本。![]() Hoechest 染色检测细胞凋亡的操作流程 适用于检测培养的细胞和组织样本。细胞爬片/切片:将灭菌小圆玻片放入 24 孔板,将合适密度的单细胞悬液加入孔中培养过夜,细胞就能长在玻片上。 石蜡/冰冻切片水化后直接 Hoechst 染色。 ◆ 可以检测培养细胞的凋亡,也可以检测组织切片里的细胞是否发生凋亡。 ◆ 细胞爬片制备:用浓硫酸和重铬酸钾配制的玻璃清洁液浸泡小圆玻片过夜,腐蚀掉玻片表面的脏东西;用流水冲洗玻片,用丝绸布(蛋白质,不会掉纤维)擦干净玻片;将擦干净的玻片一片片平铺在耐高温的玻璃皿(预先放几张吸水纸)中的吸水纸上,高温高压灭菌烘干;在超净台中用灭菌的镊子把玻片放入 24 孔板。 ◆ 加单细胞悬液时控制好量,只加在玻片范围内,防止细胞长到玻片的反面,影响后续观察。 ◆ 移动平板时也要端平慢移,等细胞贴牢后再把培养基补足。 PBS 洗:培养过夜的细胞爬片去上清,PBS 洗 3 次,每次 5min。(此步可省略) 固定:细胞爬片加 4% PFA 室温固定 15-20min。如果细胞带 GFP 荧光,想在观察 Hoechst 的同时观察 GFP 荧光,就缩短固定时间到 15min,PFA 固定时间越长,GFP 荧光就越弱。 PBS 洗:弃固定液, PBS 洗 3 次,每次 5min。(洗掉 PFA) Hoechst 染色:在细胞爬片/切片上滴加 Hoechst 33342 染液(200μg/ml in PBS),室温避光孵育染色 5min 后,吸去染色液,在 PBS 中静息 5min (不要洗太久,以免被 Hoechst 洗掉) 后,封片(用抗荧光淬灭的封片剂封片)。 ◆ 小圆玻片封片:准备干净的载玻片,预先在干净的载玻片上滴 2-3ul 封片剂,把小圆玻片上有细胞的一面面向封片剂轻轻靠过去,把爬片封在载玻片上,如果玻片周围有多余的封片剂溢出,用吸水纸把多余的封片剂吸掉,能封得更牢些。小圆玻片在 24 孔板中单独用镊子不好取出,可以用一次性的针头一手轻轻撬玻片,一手用镊子夹住。 荧光显微镜拍照:UV 激发下观察和拍照。 ◆ 如果封片后要用油镜,为了避免片子移动,需要用指甲油封边;或想过两天再拍照,也需要用指甲油封边,以免封片剂干掉。 ◆ 制备好的样品暂时不拍照需要在 4℃避光保存。 推荐: Hoechst 33342, Sigma B2261 VECTASHIELD Mounting Medium, Vectorlab, H1000 抗荧光淬灭的封片剂。货号 H1200 的是带 DAPI 的,不建议用因为本实验中已经用 Hoechst 染了蓝色,不需要再用 DAPI 染色,且单独染的 DAPI 比封片剂自带的 DAPI 染的更好看。Hoechst 染色检测细胞凋亡实验分组设计 数据处理与绘图 定性分析: 定量分析: 每组都随机多拍几个视野,或全片扫描,计数总细胞数和凋亡细胞数,计算比例。将 3 次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。 3. 检测细胞凋亡:PI 染色PI 染色检测细胞凋亡的原理 PI (propidium iodide),碘化丙啶,是一种核酸染料,既能染 DNA,也能染 RNA,能发出红色荧光。 PI 不能通过细胞膜完整的细胞 (如活细胞和早期凋亡细胞) 。 需要先将 RNA 去除以排除 RNA 的干扰。 正常细胞的 DNA 是完整的,PI 能将这些细胞深染,而凋亡细胞中 DNA 是断裂成一段一段的,PI 也能结合上去,但是染色没那么深。 参考:PI 染色法检测细胞周期 PI 染色检测细胞增殖的操作流程 适用于检测培养的细胞,不适用于检测组织样本。 消化收集细胞:收集 细胞培养上清(可能是凋亡的细胞)和贴壁细胞,用含 EDTA 的 0.25%胰酶消化细胞呈单细胞悬液,DMEM+10%FBS 终止消化后,将单细胞悬液加入 2ml 圆底离心管中,1500rpm 离心 5min 沉淀细胞,弃上清。PBS 洗:加入 1ml 预冷的 PBS 重悬细胞沉淀, 1500rpm 离心 5min,弃上清,以充分去除残留的 FBS 和胰酶。固定:加入 2ml -20℃预冷的 70%乙醇重悬细胞沉淀(加乙醇时应注意边加入边轻柔吹起细胞,放置固定时细胞结成团,难以吹散而影响后续的检测),4℃固定 30min 或 -20 ℃固定过夜后, 1500rpm 离心 5min,弃上清,去除残留的乙醇。PBS 洗:加入 1ml 预冷的 PBS 重悬细胞沉淀, 1500rpm 离心 5min,弃上清后, 500ul PBS 重悬细胞。RNA 去除:加入 RNase A(工作浓度 20μg/ml),37 ℃孵育 30min,充分降解细胞内 RNA,后 1500rpm 离心 5min,弃上清。PI 染色:500μl PBS 重悬细胞沉淀,加入 25ul PI 染液(工作浓度 50μg/ml),冰上放置避光孵育染色 30min。 PI 推荐: eBioscience 00-6990 (按说明书 5μl PI 加入 100μl 细胞)流式细胞仪检测:染色后的细胞过 300 目筛,置流式管中上流式细胞仪检测,如果暂时不能检测 4 ℃ 冰箱保存待测。PI 染色检测细胞周期实验分组设计 数据处理与绘图 使用专用软件分析流式数据(可以使用 FlowJo),得到得到 Sub G0 比例。 将 3 次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。 A:正常细胞,无 Sub G0 峰。 B:凋亡细胞,因 DNA 片段化,有明显的 Sub G0 峰。 参考: FlowJo 流式数据分析基础——常见术语 Flowjo 分析细胞功能实验数据 4. 检测细胞凋亡:TUNEL 染色TUNEL 染色检测细胞凋亡的原理 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-End Labeling,脱氧核苷酸末端转移酶 TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记)TUNEL 法要素:TdT 酶、dUTP、DNA 缺口标记。 ◆ TdT 酶:末端脱氧核苷酸转移酶,是一种不需要模板的 DNA 聚合酶,可以往 DNA 上加碱基,可以催化脱氧核苷酸结合到分子的 3’-OH 端,带有凸出、凹陷、或平滑末端的单双链 DNA 分子都可以作为 TdT 的底物。 ◆ dUTP:2’-脱氧-5’-三磷酸尿苷,在 PCR 和 rtPCR 反应中可以替代 dTTP,从而防止扩增的干扰,导致产物中含有尿嘧啶。 △ 使用 dUTP 的 TUNEL 法是基础版,plus 版用 BrdU、EdU 替代 dUTP,因为 BrdU、EdU 插入 DNA 的效率比 dUTP 高,且 BrdU、EdU 有抗体,可以再用抗体检测 BrdU、EdU。 ◆ DNA 缺口标记:即检测到的阳性信号应该是位于 DNA 缺口处的。正常细胞基因组断裂很少,细胞凋亡时,DNA 内切酶激活,切断核小体间的基因组 DNA,断裂造成的缺口处会出现很多暴露的 3’-OH。TdT 酶可将标记的 dUTP 加到暴露的 3’-OH,根据标记可以进行后续观察。FITC 绿色荧光标记的 dUTP 通过荧光显微镜或流式细胞仪检测,生物素标记的 dUTP 用 DAB 显色后通过显微镜检测。![]() TUNEL 染色检测细胞凋亡的操作流程 适用于检测培养的细胞爬片、悬浮细胞的甩片或涂片、石蜡组织切片或冰冻切片样本。样本不同,处理方式有所不同:![]() TUNEL 染色检测细胞凋亡实验分组设计 数据处理与绘图 定性分析:选典型视野拍照。定量分析:每组多拍几个视野或全片扫描,计数总细胞数和凋亡细胞数,计算比例。将 3 次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。 ◆ 计总细胞数,如果是用荧光标记的,就做 DAPI 染色,把所有细胞的细胞核都染上;如果是用 DAB 显色的,可以用苏木精染细胞核。 5. 检测细胞凋亡:Annexin V-PI 双染Annexin V-PI 染色检测细胞凋亡的原理 Annexin V-PI 染色检测细胞凋亡的操作流程 (简化) 适用于检测培养的细胞(悬浮细胞、贴壁细胞),不适用于检测组织样本。 制备细胞悬液:用不含 EDTA 的胰酶 37℃ 孵育消化细胞,制备细胞悬液, 2000rpm 离心 5min(为了下一步重悬容易点,离心速度可以减慢成 1500rpm,或离心时间可以缩短成 3min,看情况调整),弃上清。 ◆ 消化贴壁细胞注意: ① 培养上清中的细胞很可能是凋亡的细胞,也要收集,消化液中的细胞也要收集。 ② 所用的胰酶不能含有 EDTA,因为 EDTA 可以螯合钙离子,而 Annexin V 与磷脂酰丝氨酸的结合是钙依赖的。洗 2 次:用 PBS 将细胞轻轻重悬洗一次,2000rpm 离心 5min,再用 1×binding buffer 重悬洗涤,2000rpm 离心 5min,弃上清。 ◆ 配制 1×binding buffer:Annexin V 通常会配一支 10×binding buffer,趁胰酶消化细胞时,用无菌去离子水稀释成 1×binding buffer(现配现用)。调整细胞浓度:使用 1×binding buffer 重悬细胞,将细胞浓度调整为 1-5×106 /ml。(用细胞计数板计数后调整,60mm 的皿,细胞单层生长,长到 90%时大概可以得到 5×106 个细胞,具体看培养的细胞大小和培养密度)Annexin V 染色 :取 100ul 细胞悬液,加入 5ul 荧光标记的 Annexin V (按试剂说明书加染料),室温避光孵育 10-15min。洗: 1×binding buffer 洗一次,2000rpm 离心 5min,200μl 1×binding buffer 重悬细胞。PI 染色:加入 5μl PI,混匀,PI 染色很快,加完就可以上机检测。流式测定。 试剂: PI, eBioscience 00-6990 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit, eBioscience BMS500FI Annexin V Apoptosis Detection Kit APC, eBioscience 88-8007Annexin V-PI 染色检测细胞凋亡实验分组设计 数据处理与绘图 定量分析:使用专用软件分析流式数据(可以使用 FlowJo),得到凋亡细胞比例。将 3 次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。 Annexin V/PI 染色检测细胞凋亡实验如何读图? ![]() 细胞计数(细胞计数板): 计数原则:压线细胞-数上不数下,数左不数右,如下图所示。 计算公式:4 个大方格中的细胞数
÷
÷
÷ 4
×
×
× 稀释倍数
×
×
× 104 = 细胞个数/ml ◆ 稀释倍数:例如,60mm的皿,细胞长到90%,消化成2ml细胞悬液,取100ul,稀释到1ml。 |
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