ONT检测到拟南芥复杂转录本

基于全长的信息，ONT 全长转录组有独特的优势，尤其是在转录本定性和定量方面，在可变剪接鉴定方面也有了极大的提升。与此同时，很多老师担心ONT 全长转录组的碱基准确性和错误类型，具体信息可以见表1。

表1 技术比较

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转录本鉴定

ONT 全长转录组的碱基质量，读长情况，比对率，转录本鉴定到底如何，我们根据真实项目的数据来看看。各个物种测序数据量从2G到10G不等，N50都在1.1Kb-1.5Kb，属于正常范围，质量值平均达到Q10，全长率基本在80%左右，与参考基因组的比对率基本都在90%以上（表2）。在转录本鉴定方面，ONT全长转录组可以鉴定到大量已知基因的新转录本。同一个拟南芥样品，二代转录组比对率是90.35%，而ONT全长转录组达到了97.74%，鉴定到的转录本总数量提升了46.6% ，其中新转录本数量从179 提升到了22807。（表3 ）

表2 ONT全长转录组特征值统计

表3 转录本数量比较ONT vs Illumina

ONT技术揭示可变剪接的复杂性

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多比对

基因组上许有多位点序列信息相似或者同源，当reads 很短时，会出现reads多比对的情况，导致在后期做基因定量时会有一定的偏差。比如，基因A和基因B存在高度相似的保守区域（蓝色方块），当进行二代测序时会有完全属于该保守区域的reads出现，这些reads在比对时可以同时比对到2个基因组区域，而三代测序由于直接测到2个基因的全长转录本，因此不会出现多比对的情况。

根据拟南芥的实测项目，我们发现二代转录组确实会出现2 个以上位点比对的情况，最多可达到8个位点；而ONT全长转录组只有极少的reads出现多比对情况，而且最多只有5个位点，比对位点越多，reads数量越少。由于二代和三代的多比对reads 数不在一个数量级，对reads 数进行log10变换后合并展示，ONT全长转录组的多比对明显降低。由此可见，通过ONT 全长转录组对转录本进行定量更加准确，获得的转录本序列信息更加真实。

多比对示意图

（来源于Oxford Nanopore Technologies官方白皮书）

拟南芥实测多比对reads分布图

（横坐标为多比对次数，纵坐标为对应的reads数）

多比对分布合并展示图

（横坐标为多比对次数，纵坐标为log10(reads数）

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饱和度

大家习惯了转录组6G 或者Pacbio系列几十G的数据量，ONT全长转录组如何选择数据量呢？各个物种的基因组大小从Mb到Gb不等，然而，其转录组大小都是在Mb 水平。因此转录组数据量的选择不会特别受物种影响。当选择2G 数据量时，对于二倍体来说，除极低丰度表达基因未达到饱和外，其他表达水平的基因均可以测得饱和，这与二代的6G 数据饱和度相似。故而2G ONT 数据能达到6G Illumina检测效果。而对于多倍体生物，尤其是异源多倍体生物，若想让数据达到饱和，则需要加大数据量才能满足后续分析要求，实测数据饱和评估图如下。

饱合度图

定量相关性图

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GC偏好性

二代转录组由于测序片段短，且存在桥式扩增，会有GC 含量和PCR碱基偏好性，在定量上并不能真实的反映转录本/基因的表达情况。我们通过实测数据，将Nanopore与Illumina平台进行比较，发现Nanopore测序数据的GC含量偏好性要明显小于Illumina，因此，ONT平台可以更真实的反映生物体内转录本的表达情况，定量更为准确。

GC偏好性图

综上，我们不难发现，ONT 全长转录组在转录本定量和全长序列信息上有压倒性优势，这是二代转录组无法实现的。或许有老师会问，转录本定量有什么用？全长转录组的结果数据怎么用到文章中？不妨看看下面这个图[2]，两种情况下鉴定到的差异表达基因A 和B，以及这2个基因鉴定到的各转录本差异表达情况。DGE表示差异表达基因，DTE表示差异表达转录本。可见，对于B基因，虽然基因水平并没有显著差异表达，但是转录本水平，B.1和B.2都发生显著变化，并且呈“此消彼长”的变化趋势。生命体可能通过控制不同转录本的表达来调控功能性蛋白的合成。

两个水平差异分析展示

下一期，我们将围绕全长转录组在动植物学研究中的应用方向进行全面展示，敬请期待。

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文：西早

参考文献：

[1] Parker M T , Knop K , Sherwood A V , et al. Nanopore direct RNA sequencing maps the complexity of Arabidopsis mRNA processing and m6A modification[J]. Elife Sciences, 2020, 9:e49658.

[2]Froussios K , Kira Mourão, Simpson G , et al. Relative Abundance of Trans ( RATs ): Identifying differential isoform abundance from RNA-seq[J]. F1000 Research, 2019, 8:213.

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