提取细胞总RNA

①在显微镜下观察细胞生长状态，并将实验中所需要的试剂预先放进冰箱中预冷。用磷酸盐缓冲液清洗细胞表面，目的是为了减少培养基中的成分对提取总RNA的干扰，以6孔板为例，该操作要小心细致，每孔加入1 ml磷酸盐缓冲液，注意将磷酸盐缓冲液打到6孔板侧壁上，不要直接冲击细胞，以免造成细胞损耗，轻轻晃动6孔板使细胞清洗充分，弃去磷酸盐缓冲液。该操作予以3次重复。

②吸净磷酸盐缓冲液，避免磷酸盐缓冲液稀释Trizol。Trizol放入4℃冰箱预冷，向6孔板内每孔加入1 ml的Trizol裂解细胞，若用12孔板提取细胞，则每孔加入500 ul的Trizol。将6孔板置于冰上15 min，也可以放置于4℃实验室摇床上摇动10 15 min，加速其裂解，等到充分裂解细胞后，肉眼可见Trizol更加浓稠，用无酶枪头将细胞吹打下来，此过程中注意个人防护，Trizol有腐蚀性，因此注意动作轻柔，保护好裸露在外的皮肤。

③将细胞裂解液转移至1.5 ml无酶EP管中，每孔1 ml 的Trizol加入200 ul的氯仿，如果用12孔板，每孔500 ul的Trizol加入100 ul氯仿。剧烈震荡混匀30 sec，冰上静置15 min。

④离心机调至4℃预冷，在4℃下12 000 rpm/min离心15 min。

⑤将EP管从离心机中取出，注意动作轻柔，此时EP管内液体分层明显，上层无色水样液体，含RNA。用无酶枪头小心吸取上层无色液体，注意不要触及中间分界的白色和下层红色液体，如果吸力太大可以用黄色枪头套白色枪头，减小吸力。将无色上清液转移至新的无酶EP管中，该操作要小心轻柔，如果一旦触及混合层，或者吸力太大，将液体再次离心分层即可。记录吸取的液体量，以免对后续实验造成影响。

⑥在前期准备中，预先将异丙醇放入4℃冰箱预冷，以免对RNA的提取造成影响，使RNA降解。向无酶EP管中加入与上清液等体积的异丙醇，轻柔混匀15 sec，冰上静置15 min。该步骤可以根据实验需要，混匀后放入-30 ℃冰箱进行过夜沉淀。

⑦离心机调至4℃预冷，在4℃下12 000 rpm/min离心15 min。

⑧将EP管从离心机中取出，注意动作轻柔，此时EP管内底部有少许白色沉淀，弃去上清液。无水乙醇放入4℃冰箱预冷，用DEPC水稀释成75%乙醇。每只EP管中加入1 ml的75%乙醇，用无酶枪头将沉淀吹起悬浮洗涤，如果吸力太大可以用黄色枪头套白色枪头，减小吸力，注意不要吸走沉淀。离心机调至4℃预冷，在4℃下12 000 rpm/min离心15 min。弃去上清液，再次向每只EP管中加入1 ml的75%乙醇，重复洗涤步骤，再次离心。

⑨弃去上清液，将EP管倒扣放在干净纸巾上，用干净棉签小心擦去EP管内残留75%乙醇，注意不要擦去沉淀，静置10 min。根据RNA沉淀量加入适量DEPC水混匀，轻柔吹打，溶解RNA。在EP管上标记提取时间、细胞名称、EP管编号、实验人员姓名等基本信息。

2) 检测RNA的含量和纯度

①打开NANO DROP 2000系统，用1 ul 的DEPC水洗涤分光光度计，该操作重复3次。每管上样1 ul的RNA样品，测定RNA浓度和纯度。通过在260 nm和280 nm处的光密度值（OD）计算RNA的含量和纯度。

②RNA最好逆转录后以cDNA的形式储存。若暂不逆转录，则将RNA冻存于﹣80℃冰箱，避免反复冻存造成RNA降解。