生物纳米孔道技术是一种利用单分子电流信号的差异进行待测物区分和分子间相互作用研究的单分子分析方法，具有操作简单、高灵敏、高分辨、无需标记等优势，被认为是最具潜力的第三代单分子测序技术之一[8, 9]。1996年，α-溶血素(α-Hemolysin)生物纳米孔道被用于DNA单分子检测[10]，自此以来，生物纳米孔道技术已经在核酸测序[11]、DNA损伤检测[12, 13]、蛋白质测序[14–17]与构象解析[18–20]以及单分子反应监测[21–24]等方面取得了重要进展。经过不断优化迭代，便携式电化学微弱电流测量仪器及配套的数据软件性能也日益完善，确保了本实验能够在有限的教学空间和教学时间内顺利完成。例如，笔者课题组自主研发了Cube电化学测量仪器及SmartNanopore系列数据记录软件[25–28]，仪器主要包括集成化信号处理主机以及装配有前置电流放大器探头的法拉第屏蔽箱，两者尺寸分别仅为12 cm × 12 cm × 8 cm和7.5 cm × 5.5 cm × 12.5 cm，法拉第屏蔽箱可极大地消除周围环境的电磁噪音干扰，使其能够在常规实验教室进行纳米孔道实验教学；自主开发了PyNanoLab数据处理软件(https://www.pynanolab.com/)，能够实现从原始数据导入到结果图表绘制的全过程、快速处理分析，大大缩短了纳米孔道实验教学所需的时间，可以充分满足实验教学需求。因此，笔者团队在多年从事纳米孔道单分子研究的基础上，设计了利用生物纳米孔道电化学技术测量单个生物分子的综合化学实验，主要包括课前基础知识讲解、仪器和实验培训、学生自主实验以及头脑风暴环节四部分内容，旨在以兴趣为导向，激励学生主动学习、自由讨论和自主创新。该实验以气单胞菌溶素(Aerolysin)生物纳米孔道检测单个生物分子为实验范例，于2019年依托南京大学化学实验教学中心开设试行，并根据教学实践不断改进和完善，获得了良好的教学效果[29]。由于单分子检测灵敏度和分辨率主要取决于生物纳米孔道测量界面的物理化学性质[30–35]，本实验选择使用突变型T232K/K238Q Aerolysin生物纳米孔道检测多肽磷酸化，模型分子是Tau蛋白微管结合区域的多肽片段，Tau蛋白磷酸化与多种神经退行性疾病(如阿尔兹海默症)相关。随着纳米孔道单分子DNA测序的基本实现，近年来，准确还原蛋白质“原貌”，实现多肽/蛋白质测序及其翻译后修饰检测逐渐成为生物纳米孔道研究热点，但是要真正达到实际应用的目的仍有诸多问题需要解决[36, 37]。因此，本实验兼具综合性和前沿性，能够很好地展现纳米孔道单分子技术和前沿科学研究的魅力，较好地达到培养学生的科研兴趣、团队合作和科学素养的教学目的。