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三、支原体污染

支原体是一种大小介于细菌和病毒之间，并独立生活的原核微生物，广泛存在于人和动物体内。

种类：细胞培养中常见的支原体有口腔支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体、猪鼻支原体、肺炎支原体和发酵支原体，其中前四者占据支原体污染的绝大比例。

特点：支原体大小为0.1-0.3µm，可以轻易通过我们常用于除菌的0.22µm和0.45µm孔径滤膜；并且在常规光学显微镜下无法观察到，荧光显微镜下可用DAPI染色观察到支原体污染；此外支原体无细胞壁，可以直接且紧密结合宿主细胞细胞膜，适当条件下可能导致细胞融合。

支原体污染具有隐蔽性，他们可以与细胞长期共存，培养基一般不浑浊。大部分细胞被污染后似乎无明显变化，但其实支原体会抑制细胞生长，并且导致染色体畸变等，对细胞培养实验影响巨大。

细胞房支原体污染

四、黑胶虫污染

黑胶虫是一种生物还是非生物，学术界至今还有争议。这里我们暂且将其认作是一种微生物。黑胶虫污染主要来源于血清。

特点：黑胶虫污染起初对细胞并无影响，当达到一定数量时则会影响细胞生长。受黑胶虫污染的细胞液通常清亮无变化，在高倍显微镜下可以观察到点状片状的游动小体，做布朗运动。

细胞房黑胶虫污染

五、病毒污染

病毒作为一种比支原体更小的微生物，体型在nm级，很难用常规方法检测到。病毒污染分为外源性和内源性，污染主要来源为细胞系，常见于杂交瘤细胞。

特点：病毒污染的细胞液通常清亮无变化，大部分被污染的细胞也不会产生形态及病理现象，小部分病毒会造成细胞变圆、肿胀、脱落。

病毒污染可用血细胞吸附实验、免疫荧光抗体法以及电子显微镜法检测，但其清除是十分困难的，一旦不幸被污染，建议直接重新引入高质量细胞株。

微生物污染在细胞培养中是非常常见的，也是令人头大的一件事情。所以我们一定要将问题扼杀于摇篮之中，规范实验中的各个步骤，确保细胞“宝宝”在无污染的情况下健康成长。

1．实验进行前，准备好所需的试剂和器材。玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒：1)高压蒸汽灭菌15分钟以上；2)干烤消毒140℃2小时以上。

2．培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验：将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4℃保存。

3．消化液(pH7.8)或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20℃保存。

4．超净台用紫外灯照射30-60min，并开启超净台风机运转5-10min，然后用75%酒精擦拭超净台台面，再开始实验操作。

5．实验进行时，佩戴好口罩及手套，穿上洁净实验服，有长发则将长发扎起或者佩戴帽子，避免灰尘或唾液进入培养物中。

6．进入超净台前应用75%酒精对双手及手腕进行全面擦拭，确保除菌完全。

7．实验用品用75%酒精擦拭后才能放入超净台内。

8．操作时小心取用无菌物品，应避免污染。勿碰触吸管尖头，不小心碰触后应立即更换；手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，容器打开后，倾斜45度操作，操作完成后及时盖上瓶盖。

9．每次操作只处理一种细胞；即使不同细胞使用相同的培养基也不要共享同一瓶培养基，避免细胞间的交叉污染。

10．实验用品用完应移出超净台，以利于空气流通；实验完成后用75%酒精擦拭超净台台面。

11．定期清洗或更换超净台过滤膜、预滤网。

12．此外CO2培养箱的清洁是较易被忽视的地方，应1-2个月对培养箱定期进行清洁消毒。先用75%酒精擦拭培养箱内壁、隔板、水盘2-3次，用双蒸水清洗，再用酒精棉球擦拭一遍，最后紫外灯照射1h以上或进行高温高压灭菌处理。水盘内加入无菌水（应每周更换），待培养箱内温度、湿度、CO2浓度稳定后再放入细胞。

有同学可能会问，细胞已经被污染了怎么办？还能挽救吗？

首先我们要知道，在任何情况下，完全去除细胞中的微生物污染是非常困难的！因为不管是哪一种操作，对细胞的生长而言都是一种额外刺激，很有可能导致细胞状态改变甚至死亡；而过度使用抗生素可能产生更强抗性的菌株，撤药后极易复发。

所以，对于易于重新获得的细胞株，我们建议直接处理培养物，不分敌我全部消灭，防止感染扩散！对于极为珍贵的细胞样本，我们可以尝试以下处理方法进行挽救。

笔者在多年的实践过程中接触到不少细胞培养污染问题，这里提供一款全新的细胞房支原体污染清除方案，供大家参考。润联很多成功案例显示：解决细胞间支原体污染，可以使用诺福支原体清除剂 + 比林科汉干雾过氧化氢灭菌设备。

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