黄热病病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

Yellow Fever Virus(YFV) qRT-PCR Kit

产品及特点:

本产品就是以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门 检测黄热病病毒的试剂盒。

它具有下列特点:

1.即开即用,用户只需要提供样品 RNA 模板。 2.引物和探针经过优化,灵敏性高。 3.提供阳性对照,便于区分假阴性样品。 4.特异性高,引物是根据黄热病病毒高度保守区设计,不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。 5.本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。 6.本产品只能用于科研。

规格及成分:

编号

成分

规格

试剂一

探针法 qRT-PCR 缓冲液

500 μL(蓝盖)

试剂二

探针法 qRT-PCR 酶混合液

100 μL(红盖)

试剂三

荧光 PCR 专用模板稀释液

1 mL(黄盖)

试剂四

黄热病病毒探针法qRT-PCR引物混合液

100 μL(白盖)

试剂五

黄热病病毒qRT-PCR 探针

50 μL(棕色管)

试剂六

黄热病病毒探针法qRT-PCR阳性对照(1×10E8 拷贝/μL)

50 μL(黄盖)

使用手册

1 份

运输及保存: 低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。

自备试剂: 样品 RNA。

使用方法 一、稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。

由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传 染性 病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传 染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液, 用带芯枪头,下同)。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备:

7. 如果有 N 个样品, 设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。

三、Probe qRT-PCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行):

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后 加):

成分

样品管 N+2 个

RT-PCR阴性对

照管

标准曲线样品管(2-7 管)

探针法 qRT-PCR 缓冲液

各 10 μL

10 μL

各 10 μL

探针法 qRT-PCR 酶混合液

各 2 μL

2 μL

各 2 μL

黄热病病毒qRT-PCR 探针

各 1 μL

1 μL

各 1 μL

黄热病病毒探针qRT-PCR引物混合液

各 2 μL

2 μL

各 2 μL

待测样品 RNA 模板

各 5 μL

--

--

超纯水

--

5 μL

--

第7步所得标准曲线样品稀释液 (2-7 号)

不加

不加

各 5 μL(2 号样到 2 号管,3 号样到 3 号管…)

11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 qRT-PCR:

过程

温度

时间

逆转录

50℃

30 min

预变性

94℃

10 min

qRT-PCR反应

(35 个循环)

94℃

15 sec

60℃

1 min,(采集 FAM 通道的荧光信号)

四、数据处理:

12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。

特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。