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作者：

李玲玉

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摘要：

细胞中氨基酸,葡萄糖和脂肪酸等能量物质代谢一直处于动态平衡,构成细胞能量内稳态(Energy homeostais).机体能量内稳态失衡是造成人类,家畜和鱼类等动物体内各种代谢紊乱的重要原因.在当前鱼类养殖中,普遍存在以脂肪严重沉积为表征的代谢性疾病,造成鱼类生长缓慢,免疫力低下,营养品质下降等问题,严重影响到水产品的品质和安全,已经严重阻碍了水产养殖业的可持续发展.因此,探究鱼类能量内稳态调节机制就显得尤为迫切和重要.线粒体脂肪酸β-氧化(FAO)系统,又被称肉碱-脂酰转移酶(CPT)线粒体膜穿梭系统,是细胞能量代谢的重要过程,在维持细胞能量内稳态中发挥至关重要的作用.在许多哺乳动物代谢研究中,已经将线粒体FAO系统作为调控脂类代谢,研究动物能量内稳态调控机制的重要靶点.而L-肉碱(L-carnitine)和肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)作为线粒体FAO过程中关键的调节因子,也已经成为线粒体FAO功能研究中的目标调控节点.鱼类的能量内稳态研究至今尚未完全开展,而线粒体FAO系统在鱼类能量内稳态维持和调控中的功能更无人知晓.因此,本研究通过药物抑制内源性肉碱的合成建立低肉碱尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)模型,并运用基因编辑技术建立cpt1b基因敲除斑马鱼(Danio rerio)模型,探究线粒体FAO系统在鱼类能量内稳态中的调节作用及相关调控机制.在本研究过程中,通过生化检测方法,转录组和代谢组分析,同位素标记营养素示踪技术,RT-PCR,Western blot分析,组织学分析,细胞生物学手段和多种营养学检测方法的使用,系统而深入地探究了线粒体FAO受抑制对鱼类能量代谢的影响和参与的重要信号通路,以及线粒体FAO系统对鱼类摄入高能饮食的调节作用.研究发现,不论是肉碱缺乏,还是cpt1b缺失,都显著降低了鱼类线粒体FAO系统的活性,引起鱼类能量代谢稳态重塑(Remodeling),包括提高胰岛素敏感性而促进碳水化合物的利用,通过减少氨基酸分解和促进蛋白质合成而增加鱼体蛋白质沉积.在此代谢稳态的重塑过程中,细胞中AMPK/AKT-mTOR信号流的激活起到了重要的调控作用.此外,本研究也证明,线粒体FAO系统是鱼类适应高能饲料摄入的重要调节位点.本论文的主要结果如下:1.低肉碱罗非鱼的营养素代谢特征研究L-肉碱作为线粒体FAO过程中重要的调节因子之一,在脂类分解代谢和能量内稳态中发挥重要作用.本研究首先通过补充肉碱合成抑制剂-米屈肼(MD,每天1000 mg/kg鱼体重)的饲料饲喂罗非鱼6周,建立了低肉碱-FAO受抑制的罗非鱼模型.通过生理生化和分子指标的检测,初步探究了抑制线粒体FAO对罗非鱼营养素代谢的影响.研究结果发现,MD饲喂后显著减少罗非鱼肝脏和肌肉组织中的游离肉碱含量,同时显著降低线粒体FAO的效率,增加过氧化物酶体FAO活性和线线粒体增殖.线粒体FAO受抑制的罗非鱼增加全鱼总脂含量和血清中甘油三酯(TG)和非酯化脂肪酸(NEFA)的浓度,以及肝脏中的TG含量.RT-PCR结果显示,肝脏和肌肉组织中FAO过程基因(cpt1a,cpt1b和aox1)和肝脏组织中脂类合成基因(dgat2和srebp1)的mRNA表达显著上调.然而,抑制线粒体FAO不改变罗非鱼血清中转氨酶(AST和ALT)的活性和丙二醛(MDA)的含量,也不影响肝脏和肌肉组织中细胞损伤和炎症相关基因的表达.本研究还检测了糖代谢相关的生化和分子指标,结果发现,抑制线粒体FAO显著降低罗非鱼血糖和胰岛素浓度,通过增加胰岛素敏感性,上调葡萄糖吸收和糖酵解过程,加快血液中葡萄糖的清除速率;提高糖酵解酶(PK和HK)的活性,增加肝脏和肌肉组织中糖酵解产物(丙酮酸和乙酰辅酶A)的含量;通过抑制糖异生和糖原合成过程,降低组织中糖原含量.此外,蛋白质代谢相关指标的结果显示,抑制线粒体FAO可增加罗非鱼全鱼和肌肉的总蛋白质含量,降低血清中总氨基酸(TAA)浓度,提高肌肉组织中各类氨基酸的水平.并且,线粒体FAO受抑制的罗非鱼通过下调氨基酸分解代谢基因(asns,glud1,atf4和gcn2),来降低氨基酸的分解.以上实验结果表明,抑制线粒体FAO能增加罗非鱼的碳水化合物分解代谢和蛋白质沉积.因此,本部分工作发现线粒体FAO的抑制可以改变罗非鱼的营养素代谢平衡.2.抑制线粒体FAO改变罗非鱼能量代谢平衡的代谢生化机制研究为了更精确和系统地阐述线粒体FAO受抑制后改变罗非鱼能量代谢的代谢生化机制,本研究运用了同位素标记的营养素示踪技术,以及转录组和代谢组分析方法,从活体水平和离体组织,对线粒体FAO受抑制的罗非鱼整体的营养素代谢过程和代谢产物的变化进行了详细分析.活体腹腔注射~(14)C标记的营养素示踪实验结果显示,线粒体FAO受抑制的罗非鱼对~(14)C标记棕榈酸的完全氧化显著减少,主要以脂肪的形式沉积在鱼体内;然而,~(14)C标记葡萄糖注射后,线粒体FAO受抑制的罗非鱼氧化释放出~(14)CO_2的量明显增加,鱼体~(14)C的沉积率降低,而~(14)C标记蛋白质的沉积增多.此外,线粒体FAO受抑制的罗非鱼注射~(14)C标记氨基酸后,增加~(14)C标记蛋白质的沉积.这些实验结果进一步说明,线粒体FAO受抑制的罗非鱼改变对三大营养素的代谢利用,且更倾向于分解葡萄糖,沉积脂肪和蛋白质.罗非鱼肝脏的转录组分析结果发现,抑制线粒体FAO改变肝脏组织的代谢模式,而KEGG通路富集结果发现,差异基因(DEGs)主要是在代谢过程(75.68%)和代谢信号通路(10.22%).线粒体和过氧化物酶体FAO过程中基因(acs,cpt1a,cpt2,acox,acot和vlacs)上调,脂肪水解基因(pnpla3,lipea,pld4和lipin3)下调;此外,糖酵解途径(gckr,gck和pfk)和丙酮酸代谢过程(phha)上调,糖异生过程(pck1和g6p)和糖原合成途径(pgd和gys1)下调;也发现氨基酸分解(glud1b,atf3和asns),蛋白质水解过程(xpnpep2,cstba和ctsc)和蛋白酶体中蛋白质分解的一系列相关基因的表达显著下调,并且许多氨基酸相互转化的基因明显上调.这些结果表明,线粒体FAO受抑制的罗非鱼补偿性地增加FAO过程,减弱脂肪分解过程,同时改变有助于碳水化合物分解和蛋白质沉积的代谢过程.此外,代谢组分析结果发现,线粒体FAO受抑制的罗非鱼肝脏组织中检测到39种差异代谢物,其中绝大部分都是增加的脂类物质,也存在几种减少的碳水化合物中间代谢物,以及几种增加的必需氨基酸.上述实验结果表明,抑制线粒体FAO会影响罗非鱼能量代谢通路上关键基因的表达,并改变细胞内代谢物的水平,从而重塑细胞内能量代谢稳态.3.抑制线粒体FAO诱发能量内稳态重塑的分子机制研究为了阐明抑制线粒体FAO而诱发罗非鱼能量内稳态重塑的分子机制,本研究分别从离体组织和细胞水平,运用Western blot分子技术和细胞信号分子药物抑制的方法,对能量代谢稳态调节信号蛋白进行了分析.组织中蛋白分子定量结果发现,线粒体FAO受抑制的罗非鱼增加肝脏组织AMPK的表达,以及激活肝脏和肌肉中AKT胰岛素信号通路上的关键蛋白(p-AKT和IR),说明AMPK蛋白表达增加,激活了AKT信号通路,促进胰岛素敏感性;此外,肝脏和肌肉组织中mTOR信号通路的关键蛋白(p-mTOR和p-S6)的表达也增加,说明蛋白质合成调控关键通路被激活.接着,本研究通过1 mM MD处理36小时,建立了线粒体FAO受抑制的罗非鱼肝原代细胞模型,重现了活体中营养素分解代谢的表型,即葡萄糖分解增加,氨基酸氧化减弱;并通过1 mM MD处理36,48和72小时,在细胞水平上验证了激活的AKT和mTOR信号通路.为了进一步探究两个信号蛋白的关系,本研究分别使用了AKT抑制剂(MK-2206 2HCl,MK)和mTOR抑制剂(雷帕霉素,Rap),结果发现,抑制AKT活性,mTOR的表达显著降低,而抑制mTOR活性,对AKT的表达无影响,说明mTOR的表达依赖于AKT的激活.以上实验结果表明,抑制线粒体FAO能够激活罗非鱼体内AMPK/AKT-mTOR信号流,从而来维持能量代谢稳态.4.cpt1b敲除斑马鱼的代谢特征和能量稳态调控机制研究为了避免肉碱合成抑制剂的副作用,本研究利用基因编辑技术CRISPR/Cas9全身性敲除cpt1b基因,建立了线粒体FAO受抑制的斑马鱼模型,对其能量代谢特征和代谢稳态维持机制进行了分析.斑马鱼幼鱼能量代谢结果发现,cpt1b敲除斑马鱼在幼鱼期表现出较低的运动活力和氧气消耗率,并增加全鱼的脂肪含量.成鱼代谢分析结果显示,cpt1b缺失促进鱼体生长,并降低组织中线粒体FAO活性,增加组织和全鱼的脂肪含量,上调肝脏脂合成代谢活性.同时,cpt1b缺失也降低斑马鱼血清中葡萄糖和胰岛素的水平,并增加血液中葡萄糖的清除能力,减少肝脏和肌肉组织中糖原含量和增加肌肉组织中丙酮酸和乙酰辅酶A浓度,而且增加肝脏葡萄糖转运蛋白(glut2)表达,上调糖酵解过程和下调糖异生和糖原合成途径,并激活组织中AKT信号蛋白.此外,cpt1b缺失增加全鱼和躯壳中蛋白质的含量和肌肉中氨基酸的水平,降低组织中氨基酸的分解过程,并激活组织中mTOR信号通路.同位素示踪结果发现,cpt1b敲除斑马鱼增加对葡萄糖的氧化,降低脂肪酸和氨基酸分解,促进葡萄糖来源的蛋白质沉积.这些研究结果表明,鱼类cpt1b缺失可抑制线粒体FAO的活性,改变脂代谢稳态,并增加葡萄糖利用和蛋白质沉积,同时,AKT-mTOR信号通路参与此模型中能量内稳态的重塑过程.这些工作进一步验证了线粒体FAO系统在鱼类能量内稳态调控中的重要作用.5.线粒体FAO受抑制的罗非鱼对高脂饲料摄入的代谢适应鱼类高脂饲料(HFD)的摄入,往往会引起机体代谢稳态的失衡,对鱼类生长

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