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本研究揭示了在半沙漠环境中生长的敖汉细毛羊独特的肠道微生物组成。

编译：微科盟奇迹，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   微生物群落在动物肠道系统中起着至关重要的作用。肠道菌群结构的调节可间接或直接影响肠道健康和宿主代谢。敖汉细毛羊生长在中国半荒漠草原上，具有优异的抗应激能力。本研究通过扩增16S rRNA基因，研究了7只12月龄敖汉细毛羊的十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠肠道菌群的动态分布及适应性。结果表明，回肠和大肠(统称后肠)的微生物组成和多样性接近，两者之间的遗传距离和功能相似。多样性指数结果显示，后肠的细菌丰富度和多样性显著高于前肠。从前肠到后肠，优势菌群由变形菌门转变为拟杆菌门。在LEfSe分析中发现，Succiniclasticum在前肠中显著富集，参与琥珀酸的代谢。Ruminococcaceae和Caldicoprobacteraceae在后肠中显著富集，可降解大肠内纤维素多糖并产生有益代谢产物。此外，Coriobacteriaceae和Eggthellaceae参与类黄酮代谢和多酚的产生。有趣的是，这些独特的细菌在蒙古羊或其他绵羊品种中还未见报道。综上所述，敖汉细毛羊肠道菌群是适应半荒漠草原环境的关键因素之一。本研究结果为研究肠道菌群在提高绵羊抗应激能力和肠道健康方面的作用提供了新的见解。    

论文ID

原名：Characteristics of Bacterial Microbiota in Different Intestinal Segments of Aohan Fine-Wool Sheep

译名：敖汉细毛羊不同肠段细菌菌群特征

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：6.064

发表时间：2022.4

通讯作者：邓学梅

通讯作者单位：中国农业大学

DOI号：10.3389/fmicb.2022.874536

实验设计

图1 本研究的取样地点为敖汉旗。(A)饲养敖汉细毛羊的地理位置用红色坐标表示。地图来自中国自然资源部。批准文号：GS(2019)1652。(B)红色标记表示敖汉细毛羊所处的地理区域；这些地区属于半沙漠化草地环境。比例尺为20 km，来源：谷歌地图。

结果

1 不同肠段的测序结果和细菌多样性

总体而言，我们从7只羊的6个肠段中获得了2,455,588条原始reads。经过质量控制后得到1,302,080条clean reads。以97%的同源性聚类得到17,379个操作分类单元(OTUs)。为了研究这些微生物的共性和独特性，我们用维恩图计算各组间不同肠段共有的OTUs数量。筛选样本的频率为50%。首先，我们分析了后肠的肠段。四个后肠节段共有的核心OTUs为380个(图2A)。前肠观察到的OTUs数量为124个，比在后肠中观察到的OTUs数量少(图2B)。结果表明，前肠的微生物丰度低于后肠。

为了证明分析结果的准确性，我们进行了肠道微生物多样性分析，并使用Chao1和Shannon指数进行分析。结果表明，后肠微生物的多样性和丰富度较高(P＜0.01，F＞1.00)，后肠段(回肠、盲肠、结肠和直肠)的微生物群落差异无统计学意义(P＞0.05，F=0.78；图2C)。各样本的Good覆盖率指数均在90%以上，曲线趋于平缓。其中，前肠的指数较陡，表明前肠中检测到的OTUs丰度较高。同时，结果表明测序数据足以覆盖所有细菌群落(图2D)。

图2 测序结果和多样性的统计分析。(A)维恩图，显示后肠段之间共享的OTUs。(B)维恩图，显示前肠段之间共享的OTUs。(C)六个肠段的Chao1和Shannon指数。Kruskal-Wallis检验分析各指标差异显著性，校正后的*P值为＜0.05，**P＜0.01。(四)Good覆盖率指数的稀疏曲线。每条曲线表示组中的均值。

2 不同肠段的聚类分析和微生物组成

在以往对绵羊肠道微生物进行聚类分析的研究中，未能准确界定回肠与其他肠段的相关性。因此，我们假设回肠和大肠的细菌组成相似。为了证实这一假设，我们分析了6个肠段的微生物群落组成。发现前肠和后肠的微生物组成差异很大，回肠段和大肠的微生物组成相似。此外，前肠十二指肠和空肠的菌群相关性不高，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)解释的差异分别为29.0和7.7%(图3A)。接下来，我们进行了ANOSIM相似性分析，结果表明前肠和后肠的肠道微生物结构存在显著差异(P＜0.01，R=0.54)。 在后肠中，对于相似的微生物组成聚类，同一肠段内个体之间的相似性高于个体内部不同肠段之间的相似性(图3B)。后肠微生物主要有Ruminococcaceae、Christensenellaceae、Lachnospiraceae、Rikenellaceae和Akkermansiaceae。这五种细菌占所有肠道微生物的65%(图3B)。微生物组成的相似性可能与功能的一致性有关。在前肠中，十二指肠和空肠在个体间不聚集，空肠在个体间差异较大Burkholderiaceae、Ruminococcaceae和Saccharimonadaceae为优势菌科。为了判断不同组内样本的离散程度是否不同，我们使用了ADONIS排列检验。前肠的分散程度显著高于后肠，前肠组差异不显著。

在微生物组成的分析中，我们侧重于探索门和属水平上排名前10的细菌。分析了各分类水平上的微生物组成。在门水平上，厚壁菌门(平均52.88%)和拟杆菌门(平均30.23%)是后肠中的优势细菌；变形菌门(平均31.70%)和厚壁菌门(平均47.44%)是前肠中的优势细菌门。前肠和后肠中拟杆菌门(后肠30.16%，前肠1.95%)、疣微菌门(后肠8.02%，前肠0.19%)和Spirochaetes(后肠2.08%，前肠0.01%)的比例存在显著差异(P＜0.01，F＞1.00)(图3C)。这表明这些细菌在后肠中更活跃，表明它们在后肠的发酵和吸水过程中发挥重要作用。在属水平上，Ruminococcaceae_UCG-005、Christensenellaceae_R-7_group、Akkermansia(总和26.14%)为后肠优势属。Christensenellaceae_R-7_group的比例(后肠7.43%，前肠7.06%)在整个肠道中保持不变(P＞0.50，F＞1.00)(图3D)。与前肠相比，大多数注释的细菌在后肠中更丰富。此外，Candidatus-Saccharimonas是前肠中一种特有的细菌。

图3 敖汉细毛羊的聚类分析。(A)基于所有样本的主坐标分析(PCoA)。(B)分类树显示UPGMA聚类结果。横坐标表示样本之间的距离，组缩写后面的数字表示个体数，分支长度表示相似度。右边是羊肠道中最丰富的10个细菌科的堆叠直方图。横坐标表示细菌的比例。(C)各肠段门水平上的微生物组成。(D)各肠段属水平上的微生物组成。

3 不同肠段的微生物群落

为了进一步探索样本之间的差异，我们进行了Kaplan-Meier分析。根据聚类分析结果，我们分别对前肠和后肠进行了Wilcoxon检验和LEfSe分析。盲肠中较丰富的细菌属为Ruminococcaceae_UCG_010，回肠中较丰富的细菌属为Caldicoprobacter(属于厚壁菌门)(LDA＞2，P＜0.05；图4A)。结肠中的Coriobacteriales属于放线菌门。直肠中梭菌属的Family_XIII_UCG_001、放线菌的Eggerthellaceae和拟杆菌属的p_251_o5显著丰富(LDA＞2，P＜0.05；图4B)。在对前肠的分析中，我们发现十二指肠中显著丰富的细菌主要包括Acidaminococcaceae的Succiniclasticum。梭菌纲的瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)和Defluviitaleaceae的丰度也显著高于空肠(LDA＞2，P＜0.05；图4C)。Escherichia_Shigella、Akkermansiaceae、Veillonellaceae和Butyriciccoccus在空肠中的数量高于十二指肠，这可能与空肠的特异性消化功能有关(LDA＞2，P＜0.05；图4D)。

图4 敖汉细毛羊肠段LEfSe分析。后肠(A)前肠(C)的LEfSe分析直方图。纵坐标为组间差异显著的分类群，横坐标为显示每个分类群的LDA对数得分值的条形图。长度越长，分类单元的差异越显著，条形图的颜色表示该分类单元相对应的丰度最高的样本组。后肠(B)前肠(D)的LEfSe分析分支图。节点大小对应于分类群的平均相对丰度，空心节点代表组间差异不显著的分类群。字母标识了组间差异显著的分类单元名称。

4 微生物功能预测与肠道代谢途径

为了研究敖汉细毛羊肠道菌群的功能差异，我们使用PICRUST2进行了肠道菌群功能分析。首先，我们使用MetaCyc数据库作为参考，计算了六个肠段中代谢途径的丰度。功能丰度统计表明，更多的微生物功能与生物合成和代谢有关(图5A)。生物合成过程的丰度显著高于其他代谢途径的丰度。肠道中的主要生物学途径包括氨基酸生物合成、核苷和核苷酸生物合成、辅因子生物合成、辅基、电子载体和维生素的生物合成，以及生物合成、脂肪酸和脂质生物合成的生物过程。

为了研究肠道代谢途径之间的差异，我们使用q值＜0.05作为差异富集分析的标准。结果表明，邻苯二酚降解、水杨酸降解、芳香族化合物降解和柠檬酸循环途径在前肠中更为活跃；而后肠主要包括硫酸软骨素降解和蛋白N-糖基化合成的生物过程(图5B)。

图5 前肠和后肠微生物功能的预测分析与统计。(A)基于MetaCyc数据库的差异代谢途径的丰度。横坐标是分类的丰度计数，纵坐标是MetaCyc第二分类级别的功能通路，最右边是该通路所属的第一级分类。(B)基于metagenomeSeq方法的代谢途径差异分析。浅蓝色代表前肠，浅黄色代表后肠。右纵坐标是校正后的q值，左纵坐标是不同的途径标签。

讨论

本研究对敖汉细毛羊的肠道微生物进行了全面分析。采用16S rRNA基因测序法分析了各肠段的微生物结构、组成、显著丰富的细菌和潜在功能。小肠是消化吸收的重要器官。大肠主要吸收水分和营养物质；它还能产生乙酸、丙酸和丁酸，作为肠道细胞的营养来源。PCoA分析结果显示前肠与后肠明显分离。我们的结果与蒙古绵羊的分析结果一致。结果表明，敖汉细毛羊前肠的肠道微生物多样性和丰富度显著低于后肠。已有研究证实，小肠内微生物多样性较低。小肠内的微生物群通常受到一系列不利因素的影响，如低pH值、更快的运输时间、暴露于胆汁酸和抗菌肽。研究表明，在小肠中占主导地位的厚壁菌门和变形菌门对这些因素的耐受性更强。这就解释了敖汉细毛羊前肠中变形菌丰富的原因。变形菌门也是其他物种的优势门，如犊牛瘤胃和沂蒙黑山羊。

有趣的是，在之前对蒙古羊(中国甘肃省饲养)的研究中，变形菌门并没有被发现是优势门。然而，在中国内蒙古自治区锡林郭勒饲养的骆驼中，结果与我们的分析相似。说明肠道菌群受饲养环境差异的影响。拟杆菌门是大肠的优势门，在其他哺乳动物中也发现了同样的结果。大肠的特点是流速慢，pH为中性至微酸性，有利于拟杆菌门的定植。综上，本研究的结果表明，敖汉细毛羊回肠后的肠道环境具有较均匀的温和的pH值和低速运输的特征。在门水平上，反刍动物和单胃动物肠道微生物优势门具有一致性。 本研究结果表明，前肠和后肠中存在相同的微生物种群，并在肠道中发挥相同的功能。后肠菌群以厚壁菌门和拟杆菌门为主，其参与能量代谢并影响肥胖。此外，我们发现前肠和后肠中克里斯滕森菌科和毛螺菌科的丰度相对稳定(P＞0.05)，表明它们在肠道中起重要作用。Christensenellaceae_R-7_group是克里斯滕森菌科的成员。克里斯滕森菌科是一个相对较新的细菌科，此前研究与宿主的健康有关。此外，克里斯滕森菌科与饲料中动物蛋白的蛋白质分解代谢和肠道代谢物呈正相关。在反刍动物的研究中，Christensenellaceae_R-7_group促进了瘤胃的发育，增加了对营养物质的吸收和消化。这些结果表明克里斯滕森菌科可能是反刍动物胃肠道的重要组成部分。毛螺菌科是反刍动物肠道菌群的主要组成部分，与丁酸的产生密切相关。我们的结果与之前的研究一致，表明这些稳定的细菌参与了反刍动物的生长。 

本研究发现每个肠段都有大量的细菌。有趣的是，以往关于蒙古羊肠道细菌的报道并没有集中在这些细菌上，可能是由于饲养环境和品种适应性的差异。Butyricicoccus是一种产生丁酸的细菌，为肠道上皮细胞提供丁酸作为主要营养物质。Akkermansiaceae与胃肠道稳态和代谢平衡有关。这些前肠细菌可能是敖汉细毛羊对粗饲料具有较强适应性和耐受性的主要原因。后肠菌群中最为丰富的是Caldicoprobacteraceae和Ruminococcaceae。这些细菌可以发酵多种营养物质并产生挥发性脂肪酸。此外，可消化多糖可用于产生对肠道有益的代谢物。

研究表明，Ruminococcaceae-UCG-010和UCG-005(属水平)与反刍动物对淀粉和纤维的降解有关。这些群落可能有助于饲料在盲肠中的进一步发酵。而这些核心细菌在小尾寒羊盲肠中的丰度并不高。这种差异可能与该品种的特点和分布地区有关。小尾寒羊分布在中国山东省，以其极高的繁殖率而闻名。然而，小尾寒羊的肉质比蒙古羊差。与蒙古羊相比，本研究中鉴定的细菌以前没有报道过。然而，在其他反刍动物中(如梅花鹿)，据报道，Ruminococcaceae-UCG-010是后肠中的主要细菌物种，在那里它降解纤维素并产生短链脂肪酸(SCFAs)。在新生犊牛中也报告了类似的结果。这些观察结果与我们的研究结果一致。Coriobacteriaceae和Eggerthellaceae属于放线菌门。研究表明，Eggerthellaceae的丰度与饲料效率呈正相关。以前，对这些高度丰富的细菌的功能研究表明，Coriobacteriaceae和Egerthellaceae的菌株特别参与大豆苷元和染料木黄酮的代谢，它们可以转化为食物多酚。然而，在其他品种的细毛羊中尚未观察分析Coriobacteriaceae和Egerthellaceae。本研究认为，敖汉细毛羊代谢纤维多糖和类黄酮的能力可能与放牧环境有关。半荒漠牧场的草原组成复杂。在当前研究中，在后肠中发现的这些细菌对其他品种的绵羊不感兴趣。增加这些细菌的含量，如后肠中的Caldicoprobacteraceae和Ruminococcaceae，可提高粗纤维的消化率，同时产生有益的代谢物。 微生物功能分析表明，前肠在生物质代谢中发挥重要作用，产生重要的生物合成前体。前肠中的柠檬酸甲酯循环途径可以将丙酸代谢为丙酮酸。同时，邻苯二酚代谢和水杨酸降解在前肠更为活跃。该途径产生能量底物琥珀酸和乙酰辅酶a，参与能量代谢。琥珀酸可能参与了反刍动物的代谢产物转化过程，在琥珀酸转化为丙酸的过程中为其提供能量。因此，这些物质和细菌的共同作用为反刍动物提供了额外的能量。我们的分析表明，后肠的代谢涉及多糖的降解和碳水化合物的生物合成。然而，PICRUSt2在预测潜在功能方面仍有不足。由于16S rRNA基因扩增是基于对高变区的测序和分析，功能预测不能提供区分菌株特异性功能的分辨率，这导致PICRUSt2和任何基于扩增子的分析的局限性。这些结果证明了细菌参与代谢转化过程，并预测了其与敖汉细毛羊耐受性的潜在关系。

结论

本研究揭示了在半沙漠环境中生长的敖汉细毛羊独特的肠道微生物组成。敖汉细毛羊肠道微生物的结构和组成与较强的环境适应能力和肠道健康有关。本研究结果显示，前肠具有强大的能量代谢；后肠具有很强的消化粗纤维和产生SCFAs的能力。因此，这些研究结果为理解复杂的肠道微生物群适应生活环境提供了基础，并为通过微生物提高绵羊的抗应激能力和肠道健康提供了新的见解。

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