试剂和材料

除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为GB/T6682规定的一级水。

正丁醇( CH3CH2CH2CH2OH)。

铁氰化钾[K3Fe(CN)6]。

氢氧化钠(NaOH)。

盐酸(HCl)。

乙酸钠(CH3COON a·3H2O)。

冰乙酸(CH3COOH) 。

甲醇(CH3OH) : 色谱纯。

五氧化二磷(P2O5) 或者氯化钙(CaCl2)。

木瓜蛋白酶:应不含维生素B1,酶活力≥3500U(活力单位)/mg。

淀粉酶: 应不含维生素B1,酶活力≥3700U/g

除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为GB/T6682规定的一级水。

正丁醇( CH3CH2CH2CH2OH)。

铁氰化钾[K3Fe(CN)6]。

氢氧化钠(NaOH)。

盐酸(HCl)。

乙酸钠(CH3COON a·3H2O)。

冰乙酸(CH3COOH) 。

甲醇(CH3OH) : 色谱纯。

五氧化二磷(P2O5) 或者氯化钙(CaCl2)。

木瓜蛋白酶:应不含维生素B1,酶活力≥3500U(活力单位)/mg。

淀粉酶: 应不含维生素B1,酶活力≥3700U/g

试剂配制

1 .铁氰化钾溶液(20g/L) :称取2g铁氰化钾, 用水溶解并定容至100mL,摇匀。临用前配制。

2 .氢氧化钠溶液(100g/L) :称取25g氢氧化钠, 用水溶解并定容至250mL, 摇匀。

3 .碱性铁氰化钾溶液: 将5mL铁氰化钾溶液与200mL氢氧化钠溶液混合, 摇匀。临用前配制。

(注意：水溶液在存放过程中逐渐分解，加热或酸作用下产生剧毒氰化物。）

4 .盐酸溶液(0.1mol/L) : 移取8.5mL盐酸, 加水稀释至1000mL, 摇匀。

5 .盐酸溶液(0.01mol/L) : 量取0.1mol/L盐酸溶液50mL, 用水稀释并定容至500mL, 摇匀。

6 .乙酸钠溶液(0.05mol/L) : 称取6.80g乙酸钠, 加900mL水溶解, 用冰乙酸调pH 为4.0~5.0之间,加水定容至1000mL。经0.45μm微孔滤膜过滤后使用。

7 .乙酸钠溶液(2.0mol/L):称取27.2g乙酸钠, 用水溶解并定容至100mL, 摇匀。

8 .混合酶溶液: 称取0.40g木瓜蛋白酶、 1.27g淀粉酶, 加水定容至50mL, 涡旋, 使呈混悬状液体,冷藏保存。临用前再次摇匀后使用。

标准品

维生素B1标准品: 盐酸硫胺素( C12H17ClN4OS·HCl ) , 纯度≥99.9%

标准溶液配制

1 、维生素B1标准储备液(500μg/mL):准确称取盐酸硫胺素标准品56.1mg( 精确至0.1mg) ,相当于50mg硫胺素、用0.01mol/ L盐酸溶液溶解并定容至100mL, 摇匀。置于0℃~4℃冰箱中, 保存期为3个月。

2 、维生素B1标准中间液( 10.0μg / mL) : 准确移取2.00mL标准储备液, 用水稀释并定容至100mL,摇匀。临用前配制。

3 、维生素B1标准系列工作液: 吸取维生素B1标准中间液2mL、5mL、10mL、 15mL、30mL, 用水定容至100mL,标准系列工作液中维生素B1的浓度分别为0.2μg /m L, 0.5μg/mL,1.0μg /mL,1.5μg/ m L, 3.0μg/mL, 临用时配制。

维生素B2标准品:核黄素（C17H20N4O6)纯度98%

1 、维生素 B2 标准储备液（250 μg/mL）：称取25mg （精确至0.1 mg）维生素 B2 标准品，加入盐酸2 mL，超声溶解后，立即用水转移并定容至100 mL。置于棕色玻璃容器中在0℃～4℃冰箱贮存，保存期为3 个月。

2 、维生素 B2 标准中间液：准确吸取4.00 mL 标准储备液，用水稀释并定容至100 mL，此溶液中维生素 B2 浓度为 10 μg/mL。临用前配制。

3 、维生素B2 标准系列工作液：分别吸取维生素 B2 标准中间液1.00 mL、2.00 mL、5.00 mL、10.00 mL、15.00 mL用水溶解并定容至50mL。该标准系列浓度分别为0.00 0.20 μg/mL、0.40 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00μg/mL、3.00 μg/mL。临用前配制。

仪器和设备

高效液相色谱仪, 配置荧光检测器

分析天平: 感量为0.01g和0.1mg

离心机: 转速≥4000r/min

pH计: 精度0.01

电热恒温干燥箱或高压灭菌锅

样品前处理

称取5g固体试样或者20g液体试样于150mL锥形瓶中加60mL0.1mol/L盐酸溶液, 充分摇匀, 用牛皮纸封口, 高压灭菌锅中121℃保持30min。水解结束待冷却至40℃以下取出,轻摇数次; 用pH计指示, 用2.0mol/ L乙酸钠溶液调节pH 至4.0左右,加入2.0mL( 可根据酶活力不同适当调整用量) 混合酶溶液, 摇匀后, 置于培养箱中37℃过夜( 约16h) ;将酶解液全部转移至100ml容量瓶中, 用水定容至刻度, 摇匀, 离心或者过滤, 取上清液备用。上机测B2。

试液衍生化

准确移取上述上清液或者滤液2.0mL于10mL试管中, 加入1.0mL碱性铁氰化钾溶液,涡旋混匀后衍生10min,准确加入2.0mL正丁醇, 再次涡旋混匀1.5min转速5000r离心10min, 待充分分层后, 吸取正丁醇相( 上层)经0.45μm有机微孔滤膜过滤,取滤液于2mL棕色进样瓶中, 供分析用。另取2.0mL标准系列工作液,与试液同步进行衍生化。

注意事项

室温条件下衍生产物在4h内稳定

操作过程应在避免强光照射的环境下进行

标准物质同步进行衍生。

使用棕色样品瓶。

样品灭菌后调pH时,pH尽量调到4的时候在加入混合酶

B1样品衍生化时，加入正丁醇后，一定要在涡旋振荡器上震荡1min

室温条件下衍生产物在4h内稳定

操作过程应在避免强光照射的环境下进行

标准物质同步进行衍生。

使用棕色样品瓶。

样品灭菌后调pH时,pH尽量调到4的时候在加入混合酶

B1样品衍生化时，加入正丁醇后，一定要在涡旋振荡器上震荡1min

样品前处理流程图

仪器参考条件

色谱柱: C18反相色谱柱(粒径5μm,250mm×4.6mm) 或相当者

流动相: 0.05mol/L乙酸钠溶液-甲醇(65+35)

流速: 0.8mL/m i n

B1检测波长: 激发波长375nm,发射波长435nm

B2检测波长:激发波长462nm,发射波长522nm

进样量: 20μL

检测前色谱柱的平衡

先用水：甲醇=1:1,流速为0.7ml/min，冲洗色谱柱30min；再用水：甲醇=65:35，流速为1ml/min,平衡60min；再用检测时流动相，流速为1ml/min，平衡约60min。荧光检测器灯提前10min打开。

检测后色谱柱清洗

先用水:甲醇=65:35流速为1ml/min,平衡80min；再用纯甲醇冲洗，流速为1ml/min，冲洗70min。

分析结果的表述

试样中维生素B 1( 以硫胺素计) 含量按式( 1) 计算式中:

X —试样中维生素B1( 以硫胺素计) 的含量, 单位为毫克每百克( m g / 1 0 0g) ;

c —由标准曲线计算得到的试液(提取液)中维生素B1的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL) ;

V — 试液( 提取液) 的定容体积, 单位为毫升( mL) ;

f — 试液( 上清液) 衍生前的稀释倍数;

m — 试样的质量, 单位为克( g) 。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示, 结果保留三位有效数字。

注:试样中测定的硫胺素含量乘以换算系数1. 1 2 1, 即得盐酸硫胺素的含量。

加标回收试验：

维生素B1回收率99%

维生素B2回收率99%返回搜狐，查看