最新研究表明对免疫细胞的适当调节，有助于理解其代谢途径及代谢异常时引发免疫功能紊乱和疾病发展的机制。当前，这种理解还受限于对免疫细胞群的分析。单细胞应用技术，可评估临床样本中单个免疫细胞的代谢状态，有助于推动免疫代谢领域的发展和提高疾病诊断能力。2020年10月Artyomov等人在《Cell Metabolism》杂志上发表了一篇名为“Immunometabolism in the Single-Cell Era”的综述，回顾了单细胞应用技术及其验证免疫代谢的通用原则，概述了免疫细胞的代谢异质性，并讨论了当前免疫技术的局限性及未来的探索方向，现介绍如下：

背景  

新陈代谢是生物过程的核心。研究表明，免疫细胞的代谢途径与特定免疫功能与健康或疾病下的细胞状态密切相关。癌症和慢性炎症代谢性疾病的发生与机体核心代谢途径的失调有关，但基于疾病的复杂性和细胞表型的多样性，目前对致病环境中的免疫代谢重塑尚缺乏整体理解。

机体的营养水平、氧气供应量等改变和信号分子及邻近细胞的相互作用均可诱导代谢发生改变。细胞微环境的独特性使体内细胞在新陈代谢、细胞表型和免疫功能上均不完全相同。在单细胞分辨率下，解决免疫代谢的时空异质性并阐明机理将有助于推动免疫代谢领域的不断发展。单细胞图谱分析技术有助于帮助理解细胞代谢与免疫调节和疾病进展的机制，能阐明免疫细胞代谢转化为效应表型的轨迹。 

常见的bulk代谢分析   细胞外通量分析  

细胞外通量分析仪如Seahorse apparatus，通过动态记录细胞外酸化率(ECAR) 和耗氧率(OCR)可提供糖酵解和线粒体呼吸相关的核心数据。应用特定底物和抑制剂可探究细胞对葡萄糖、谷氨酰胺或脂肪酸的相对偏好。目前的Seahorse 分析技术可简单、快速地以96孔方式对细胞进行分析，极大扩展了免疫代谢的研究视野，但该技术无法提供有关糖酵解和线粒体内三羧酸循环（TCA循环）以外代谢途径的详细信息。应用Seahorse 分析，有学者发现炎症巨噬细胞中的糖酵解开关与线粒体功能障碍、效应T细胞和活化树突状细胞(DCs)糖酵解的增加及记忆性T细胞和IL-4活化巨噬细胞的线粒体呼吸增强有关。ECAR是糖酵解的替代标记，但培养基酸化不一定是糖酵解增强的结果，线粒体生成的二氧化碳或细胞外TCA循环代谢中间物也可使培养基酸化。

稳态代谢组学  

在特定时间点，代谢组学通过液相或气相色谱-质谱(LC-MS或GC-MS)可测量一系列代谢物的稳态浓度。非靶向代谢组学测量生物样本中的数百种代谢物，而靶向代谢组学则可预先评估代谢物并提供更具灵敏度的数据，以实现对代谢物浓度的精确定量。基于MS的方法需要较高的输入通量(一般为10万个细胞)，最新研究提出的单细胞分辨率空间测量代谢物的技术方法，把单细胞技术与基质辅助激光解吸电离(MALDI)-质谱成像和二次离子质谱(SIMS)相结合，有助于探索体内组织微环境中单细胞的免疫代谢过程。

 通量组学  

特定代谢途径的通量变化与该途径内特定时间点测定的代谢物浓度不一定直接相关。通过靶向质谱在连续时间点对底物和同位素13C或15N测量，可明确代谢通量和代谢途径动力学。单细胞代谢谱分析技术针对不同代谢蛋白可提供一些免疫代谢信息。

关键的免疫代谢概念   糖酵解解析多种免疫效应功能  

免疫活化是糖酵解通量增加的耗能过程，此过程中机体利用葡萄糖转运体摄取葡萄糖(如GLUT1)后转化为丙酮酸，将NAD+还原为NADH并生成ATP。糖酵解酶如己糖激酶1和2 (HK1和HK2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、烯醇化酶和丙酮酸激酶同工酶M2 (PKM2)均可抑制细胞免疫功能。在无氧状态下，细胞通过乳酸脱氢酶(LDH)将丙酮酸还原为乳酸以维持糖酵解通量。Seahorse 分析中，质子和糖酵解衍生的乳酸可通过单羧酸转运体MCT1从细胞中输出时，这种发酵反应称为ECAR。糖酵解在炎症免疫效应细胞中最为活跃，对多种免疫细胞的活化模式至关重要且糖酵解率在B淋巴细胞和T淋巴细胞之间表现不同。

磷酸戊糖途径在炎性髓细胞中尤为重要  

磷酸戊糖途径（PPP）是机体利用葡萄糖直接氧化脱氢脱羧生成NADPH及中间产物为其他物质合成提供原料的过程，G6P脱氢酶为该途径限速酶，生成的NADPH在免疫细胞中有多种生物学效应。中性粒细胞和炎症巨噬细胞可利用PPP及NADPH产生活性氧(ROS)发挥抗感染作用。NADPH还可作为抗氧化剂防止组织细胞的过度损伤。

TCA循环和ETC为代谢的核心枢纽  

TCA循环和线粒体电子传递链(ETC)生成的能量对机体代谢至关重要。与糖酵解相比，OXPHOS生成能量更有效且与体内免疫细胞的寿命有关。在巨噬细胞促炎活化过程中，TCA循环通过下调IDH和SDH活性而被重构，后者通过活化髓细胞中ACOD1/IRG1产生特异性免疫调节代谢物衣康酸直接抑制而实现。 

脂肪酸代谢支持免疫细胞的表型和功能    

脂肪酸氧化(FAO)是肉碱棕榈酰转移酶1和2 (CPT1和CPT2)将长链脂肪酸转运到线粒体基质后经羟酰基辅酶a氧化为乙酰辅酶a、NADH和FADH2并生成能量的过程。高浓度的CPT1抑制剂依托莫西实验表明FAO在IL-4诱导的巨噬细胞、记忆性T细胞和调节性T细胞（Tregs）中尤为重要。然而，最近对CPT1和CPT2应用细胞特异性基因敲除的文献报道表明，FAO在此过程中很少。

与FAO相反，FAS是乙酰辅酶a羧化酶(ACC)将乙酰辅酶a羧化为丙二酰辅酶a，后脂肪酸合酶(FASN)将丙二酰辅酶a延长为脂质的合成过程。FAS支持效应T细胞增殖，是配置巨噬细胞炎症信号的质膜的关键，也是促进活化的DCs分泌细胞因子的关键。

不同免疫细胞间氨基酸代谢率存在差异  

T细胞免疫活化与氨基酸代谢需求增加相关，如Ⅰ型氨基酸转运蛋白1 (LAT1、CD98和SLC7A5)及TCR对信号转导的丝氨酸途径尤为重要。氨基酸在调节免疫反应的特定方向也发挥一定作用，如Th1和Th17细胞通过转运蛋白ASCT2可增加谷氨酰胺用量应对抗原刺激，抗炎Treg则不受谷氨酰胺供应改变的影响。谷氨酰胺酶(GLS)将谷氨酰胺转化为谷氨酸为TCA循环提供燃料，该途径可促进Th17分化，同时降低Th1和细胞毒性T淋巴细胞的分化程度。   

氨基酸在炎性巨噬细胞中也有重要的调节功能。谷氨酰胺代谢与抗炎极化有关，丝氨酸代谢与IL-1b的产生有关。此外，氨基酸可促使巨噬细胞产生效应分子。LPS(+IFNγ)诱导的巨噬细胞主要通过诱导NO合成酶(iNOS)将精氨酸转化为一氧化氮(NO)，IL-4诱导的巨噬细胞则主要将精氨酸代谢为鸟氨酸和多胺。

现有细胞技术的局限性   从体外培养到体内验证的必要性  

鉴于组织微环境的重要性，实验室体外培养的细胞免疫代谢途径明显不同于体内细胞。在小鼠中应用13C-葡萄糖输注方法研究CD8+T细胞对李斯特菌感染的代谢，发现体内活化的T细胞代谢状态与体外培养的细胞不同，体外培养的T细胞在活化过程中，CD8+T细胞从OXPHOS途径向糖酵解转变，体内活化的CD8+T细胞则显示出更高的耗氧率并依靠葡萄糖依赖的丝氨酸生物合成过程。由于动物模型有其自身局限性且不能完全复制人体免疫学和生物学特征，因此将体外培养细胞的免疫细胞代谢技术引用到人体中的转换尤为重要。

免疫代谢的时空异质性尤为重要  

免疫细胞代谢依赖于营养物质的供给，营养物质的供应因细胞在肿瘤或炎症部位微环境中的位置不同而有差别。在单细胞分辨率下了解细胞代谢状态可解释体内复杂组织微环境中免疫细胞表型异质性的分子机制，有助于解释其在病理环境下不能正常发挥功能的原因。最近的转录和成像技术可解决单细胞甚至其代谢物的空间排列问题，该技术的进步对了解人体样本和体内环境中的免疫代谢重构至关重要。时空异质性是免疫代谢领域常被忽视的问题。多数免疫细胞在活化后糖酵解迅速增强使代谢通量增加。理解免疫代谢的时空异质性不仅有助于更新基础生物学知识，也有助于设计新的合理的治疗方法。

通量的限制  

免疫代谢研究中，常用的（bulk）分析技术的局限性可解释从体外到体内转化和从动物到人体的验证难题。代谢组学和细胞外通量分析需要较高的细胞数量，在人类临床样本中通常难以实现。如Seahorse 分析XF分析仪测量每孔中数万到数十万个细胞的细胞外通量时只需4-5个复制孔。对于代谢组学，则通常需要测量复制的50万个混合细胞，通过此技术获得的代谢信息有限。细胞外通量分析和传统代谢组学的另一缺点是其评估的代谢特征具有不稳定性，结果受分析时长和荧光活化的细胞分选仪影响。因此，需要新的代谢谱分析方法及新的、优化的细胞分离方法来测量体外特殊免疫细胞的稳定代谢特征。

利用不同的组学方法可进行间接代谢评估  

代谢组学与转录组学和蛋白质组学等技术相结合，可部分解决代谢物水平不稳定性难题。代谢通量可视为代谢物水平和代谢酶活性的结果。转录组学和蛋白质组学可为代谢途径的调控提供一些见解，当与代谢组学数据整合时变得更加强大。利用网络整合方法，结合代谢组学和转录组学数据已证明含脂巨噬细胞中PPP与炎症反应程度有关。蛋白质组学和代谢组学的整合则揭示了T细胞活化的代谢需求。

目前单细胞代谢组学的大规模应用还为时过早，免疫代谢研究进入单细胞时代还需要寻找新的方法。先前使用群细胞转录组学和蛋白质组学描述细胞代谢的成功表明，单细胞组学技术将是未来的探索方向。

单细胞RNA测序(scRNA-seq)的出现使得在复杂的多细胞生态系统中解析单个细胞转录谱成为可能。应用10x基因组学管道，scRNA-seq实验每样本中多达1万个细胞，可常规检测每个细胞2到4千个基因。即使在免疫学背景下直接检测scRNA-seq数据，也可发现在体内的核心代谢过程。

细胞群转录分析可提供细胞序列在转录水平内的详尽信息。细胞信号的缺失通常意味着相应转录本的缺失。转录谱分析优势在scRNA-seq数据中并不显著。每个细胞25000-50000次读取的常规测序深度，可检测3000-4000个基因。浅层测序(即检测每个细胞大约1000个基因)能发现大多数普通和管家基因。然而，即使每个细胞检测出3000 - 4000个基因，也明显低于基于RNA-seq技术纯化的细胞群中的12000-15000个基因表达提供的信息丰富。此种情况下，须使用数据归因等技术对数据进行后处理而获得稳定的转录谱。在相同的scRNA-seq数据集中，不同细胞群每个细胞RNA的含量不同使得不同细胞间信息覆盖不均匀。用于scRNA-seq数据代谢分析的方法可大致分为两大类:(1)基于路径的分析方法；(2)基于通量平衡分析(FBA)的方法。

（1）基于路径的分析方法  

使用标准生物技术直接作为基因集进行探测信息途径富集技术可对构成不同代谢途径的基因进行很好的注释，如根据已发表的大量RNA-seq数据库中对该途径转录富集的初步观察，研究了T细胞中丝氨酸代谢的作用。 

（2）基于通量平衡的分析方法  

FBA是一种计算系统中代谢通量稳态分布的方法。简单地说，FBA将细胞内的代谢视为一个输入输出水龙头数量有限的管道系统，要求系统的每个节点都建立稳态平衡。单个酶的特异性表达水平并不直接参与建模，透视图的结果主要依赖于网络拓扑结构和模型的输入和输出。输入通常是最常见的底物摄取反应(如葡萄糖，谷氨酰胺)，输出(通常称为目标函数)与被研究的特定细胞行为相关。

基于FBA方法的优势在于其依赖于网络分析，而不与预先定义的通路知识相关联，这可揭示新的生物学概念以了解随着网络拓扑结构的变化而发生的代谢通量变化。此前，大量数据采用此法揭示了衣康酸作为SDH抑制剂的作用。最近，该方法被引入到scRNA-seq数据中，以研究致病性/非致病性Th17细胞的代谢差异及与Tregs的差异。

当前方法通常关注不同细胞群之间的差异。在这些情况下，更直接的方法是简单地进行两个种群之间的差异表达分析，并执行通路富集分析或代谢网络分析。未来的代谢scRNAseq分析方法有望揭示独立于细胞本身分配的主要代谢变异。虽然目前在所有代谢基因的空间中简单地进行这种聚类或使用注释的代谢途径作为主要成分是可行的，但最强大的聚类方法在没有单细胞途径先验知识的情况下结合基于网络的分析依然是困难的。

基于蛋白质的单细胞代谢分析   通过流式细胞仪检测单细胞代谢谱  

虽然单细胞内蛋白质的非靶向分析仍处于初级阶段且尚未应用于免疫代谢研究，但最近文献显示使用大量细胞计数(CyTOF)可估计单细胞内酶的代谢配置。

设计一个免疫代谢CyTOFpanel，根据免疫细胞谱系标记物的表达模式识别出不同的免疫细胞亚群后，可估计和比较所有免疫细胞亚群的代谢状态，而不需要预先分类。通过流式细胞术获得的代谢状态谱与所描述的在特定免疫功能中的作用一致，例如在DCs中高表达葡萄糖和脂肪酸代谢相关的靶标及在中性粒细胞中高表达的PPP限速酶G6PD。已经证明Seahorse 分析测量的T细胞代谢变化与蛋白水平上单细胞分辨率观察到的变化高度一致，表明基于CyTOF的单细胞代谢谱可通过测量细胞群建立的代谢重构获得新的见解。

免疫代谢CyTOF在体外环境中的应用  

通过比较大肠癌患者的肿瘤和健康组织及健康供者外周血单核细胞和淋巴结，发现肿瘤相关CD8+T细胞富集的特定代谢表型，这些细胞显示出大型中性氨基酸转运体1 (LAT1, CD98)表达增加，而不同代谢途径中多种酶的表达减少。一小部分细胞亚群不表达PD1或CD39，这表明结合代谢和免疫细胞标记将在定义细胞表型和功能上与人类疾病有关的肿瘤相关免疫细胞上提供额外维度。

基于细胞因子的代谢谱在动物模型中的应用  

除人类样本，代谢细胞的panel可用于获取动物模型体内的代谢重塑信息。有研究将单核增生李斯特菌感染期间T细胞反应的基于CyTOF代谢谱作为CD8T细胞分化的模型。事实上，效应T细胞显示的糖酵解活性的预期增加可通过CyTOF分析中的GLUT1和GAPDH诱导得到证实。相反，记忆T细胞表现出CPT1a的诱导与CD8记忆T细胞相关。这种代谢重组可在单细胞分辨率下被发现，其代谢特征包括活化后早期的糖酵解开关与活化的异质GAPDH表达相关。

Met-Flow:流式细胞仪测定单细胞代谢谱  

通过使用荧光标记抗体代替重金属耦联抗体，可分析单细胞代谢谱。Met-Flow以流式细胞术为基础，使用10种荧光染料共轭门控抗体，针对不同代谢途径中的限速酶和关键蛋白，结合细胞表型标记，生成27色流式细胞术panel以检测免疫细胞的代谢状态。有研究表明使用针对与特定免疫效应功能相结合的关键代谢酶的抗体来扩展传统细胞检测panel可能更有益。使用相对较小的细胞检测panel包括一些代谢抗体，可为进一步分析免疫细胞的表型、功能和代谢提供大量信息。

值得注意的是，Met-Flow仅通过scRNA-seq分析识别了10种代谢蛋白，其分辨率可与500个基因的分辨率相比较，而单独分析这10种蛋白的表达并不能解析免疫群体。此外，Met-Flow证实了T细胞激活时糖酵解、OXPHOS和FAS的上调，这种代谢重组可被细胞外通量分析所证实。新的单细胞Met-Flow分析表明，大多数细胞依赖于葡萄糖来进行代谢转换，因此单细胞代谢图谱能够识别特定的代谢特征及单个T细胞亚群的需求。

与此同时，两种方法测定的细胞数量不同，目前每个样本的scRNA-seq被限制在大约10000个细胞，而流式细胞术可常规处理数百万个细胞。此外，单细胞转录谱分析成本几乎比流式细胞术运行的成本高一个数量级，但scRNA-seq对细胞形态变化更敏感。许多细胞类型由于细胞形状和仪器设计的不兼容性而不能精确地描述。

另一方面，转录分析的显著优势在基于单核RNA-seq的利用。应用此方法可分离单细胞并绘制相应的转录谱。该技术避免了形态学的影响，允许对冷冻样本进行分析，包括多年前已经保存在生物库中的样本，从而开启了从临床样本中研究群细胞的能力。

总之，在受控实验设计的设置中，主张采用组合方法，在有限的规模上应用scRNA-seq，以探索复杂的代谢变化情况，然后使用假设驱动的抗体panel在蛋白质水平进行大规模的细胞分析验证。

单细胞代谢组技术的优点和缺点   流式细胞术在单细胞免疫代谢研究中的应用  

流式细胞术是分析免疫细胞最常用的方法，但受限于荧光溢出使其可同时测试的参数数量相对有限。与荧光探测器不同，CyTOF使用mass cytometer来检测每一种金属的质量，其检测重叠和背景量(流式细胞术中的自体荧光)均很低。设计理想的CyTOFpanel以减少“荧光溢出”并考虑不同金属信号强度的差异仍然是该技术的关键。虽然在流式细胞术中需要快速获得染色细胞以防荧光漂白，但金属标记的样本可在低温条件下保存数周并可在临床试验期间通过收集样本获得。

光谱分析仪正在推动流式细胞术的发展。使用5种激光来检测64通道的全发射光谱，能够以灵敏、快速和可访问的方式检测30多种颜色，可将针对代谢蛋白和免疫谱系标记的荧光标记抗体与荧光代谢工具结合起来，提供额外的代谢信息，对免疫代谢研究尤为重要。

免疫代谢的空间解决方案   MIBI-TOF作为基于蛋白质的空间单细胞免疫代谢分析技术  

有研究将其建立的CyTOF panel转移到多路离子束成像(MIBI-TOF)平台，为空间代谢谱研究方面迈出了重要一步。这种最近开发的方法将单细胞代谢谱、免疫细胞表型和功能状态结合到细胞间相互作用的微环境中，其优势在于通过MIBI-TOF获得包括空间信息在内的高维数据。

细胞群在微环境中其代谢谱具有相似的代谢特征。在表达高水平与糖酵解相关代谢因子的细胞中，线粒体呼吸或氨基酸代谢经常被表达相同代谢目标的邻近细胞包围。在比较邻近肿瘤边界和远离肿瘤边界细胞的免疫代谢谱时发现微环境驱动的代谢极化尤为明显。通常，代谢受抑的细胞离肿瘤边界较远而代谢活跃的细胞位于肿瘤免疫边缘。MIBI-TOF方法可在从生物样本库获得的FFPE材料上进行，这将提供免疫代谢谱、细胞微环境与临床疗效相联系起来的可能。因此，单细胞代谢图谱是将免疫代谢研究转化为临床诊断和治疗的重要进步。

利用脱氢酶活性测定原位微环境中的代谢图谱  

有学者提出利用脱氢酶活性可测定原位微环境中的代谢图谱。对催化核心代谢途径关键步骤的五种酶活性进行测定:PPP中的G6PD，糖酵解中的GAPDH，乳酸发酵中的LDH以及TCA循环中的IDH和SDH，当这些脱氢酶活跃时，NAD(P)H可将硝基蓝四氮唑氯(NBT)还原为一种可定量的强着色状态并与连续切片上获得性免疫细胞标记物的表达有关。肿瘤内产生IL-6和TNF的巨噬细胞与TME内的非炎性巨噬细胞相比，糖酵解GADPH活性增加，但与健康组织的巨噬细胞相比，整体肿瘤相关巨噬细胞则表现出代谢抑制，因此推测肿瘤中巨噬细胞代谢适应性受损可能会降低其抗肿瘤活性。此外，与健康组织中的Tregs相比，肿瘤环境中的Tregs则表现出糖酵解GAPDH活性被抑制、线粒体SDH增加等代谢特征。识别这种肿瘤特异性的免疫细胞亚群代谢特性有助于开发新的治疗方法。

“论肿道麻”述评

从单细胞水平上理解免疫代谢技术转型是研究免疫代谢的主流趋势。如前所述，特定的细胞代谢特征可通过scRNA-seq谱技术获得，甚至可通过混合细胞培养/大量体外样本经过特定的蛋白靶向板进行解剖分析获取。虽然CyTOF和scRNA-seq等方法可对不同细胞亚群的代谢重构提供重要信息，但这些方法获取的数据仍然是间接、有限的。提高单细胞测量深度和质量的数据分析能力及有效解决免疫细胞的时空异质性特性是未来免疫代谢领域研究需要攻克的方向。

未来研究中，需要探索出对单细胞代谢物进行直接分析的方法技术，此种方法不仅要实现对代谢物浓度的直接测量，也需要在单细胞水平提供通量组学信息。考虑到代谢组学的不稳定性及分离细胞可能产生偏差的事实，单细胞代谢组学可能不在于测量悬浮分离细胞中的代谢物，而是利用基于MS的成像方法来从空间上解析组织微环境中单细胞的代谢配置难题。

机体细胞是高度分隔的结构，不同亚细胞微环境中分布着不同生物学功能的代谢物，因此单细胞分辨技术不是免疫代谢领域研究的最终阶段。提高代谢读数的亚细胞分辨率将为免疫代谢领域提供一个崭新层面。在互补组学分析背景下，通过CITE-seq方法实现蛋白质和转录组水平的融合在免疫代谢领域具有重要前景。鉴于当前对免疫代谢调节的理解是通过体外高度调控的环境获得，针对体内表型的代谢干预设计仍依赖于现有知识储备。了解群细胞免疫代谢重塑的基本原理将有助于从影响关键细胞代谢通路中获取关键信息，为治疗疾病提供新的见解及方法。

总之，免疫代谢发展为一门系统科学还需要多学科的专业知识及新技术来解决研究中的一些难题。为成功过渡到单细胞免疫代谢时代，提高免疫数据分析及检验免疫学在体内和体外的可用性、可交互性方面都尤为重要。

编译：石平；述评：翁梅琳   审校：张军，缪长虹 参考文献：   Artyomov MN, Van den Bossche J. Immunometabolism in the Single-Cell Era.    Cell Metab   . 2020;32(5):710-725.