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《抗生素生产工艺学》笔记

《抗生素生产工艺学》笔记

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绪论

第一章抗生素概述

第一节抗生素是怎样的物质

一、抗生素定义

抗生素是生物在其生命活动过程中所产生的，或经其他方法（生物化学或半合成）衍生的。

在低浓度下，具有选择性地抑制或杀灭它种生物机能的一类化学物质。

如青霉素、氯霉素（也可合成）、氨苄青霉素（半合成品）等。

克霉唑：

至今还未发现哪种微生物可以合成。

所以不能算抗生素，只能算抗菌药。

二、抗生素的形成及其生物学意义

微生物量多，种多，分布广。

有共生，有拮抗，有自发突变，有诱发突变。

随着抗生素合成机理和微生物遗传学理论的深入研究，目前人们已经了解到抗生素有别于其他（初级）代谢产物。

抗生素是次级代谢产物。

次级代谢产物还有生长素（赤霉素），毒素（如黄曲霉素）。

这些产物与微生物的生长繁殖无明显的关系，是以基本代谢的中间产物如丙酮酸盐，乙酸盐等作为母体衍生出来的。

其结构性质随不同微生物种属而异，因此次级代谢产物很多。

基本代谢产物如蛋白质、脂肪、多糖等物质，直接与微生物的生长繁殖相关。

这些物质的构造也因微生物种属不同而异，但产生这些物质的代谢过程基本相似。

在某些放线菌中发现次级代谢产物与染色体外的遗传因子——质粒也有关系。

微生物生产抗生素的原理：

控制发酵条件，使抗生素产生菌的代谢向合成抗生素的方向发展，从而有利于抗生素的产生。

三、医用抗生素应具备的条件

1．“差异毒力”大；

2．不易产生耐药性；

3．副作用小（如不产生过敏反应）；

4．具有较好的理化性能，便于提取、精制、贮藏；

5．在人体内应发挥其抗生效能，并不立即遭体内破坏。

6．给药（注射，口服等）后，很快吸收，并分布到被感染的器官或组织。

第二节抗生素发展史

相传2500多年前，我们的祖先就用长在豆腐上的霉菌治疗疥疮等疾病。

民间还有地方用发霉的面包，玉蜀黍等来治疗溃疡、肠道感染和化脓性感染等。

1928年Fleming在研究葡萄球菌变异时发现，污染在培养基上的霉菌抑制了细菌的生长。

－→点青霉－→青霉素－→难提取－→未引起重视－→1940年代弗洛里（Florey）和钱恩（Chain）重新研究弗来明工作－→1943～45年间，发展成了新的一个工业部门：

抗生素发酵工业。

在这期间，1944年Waksman发现了链霉素。

随后氯霉素、金霉素、制霉菌素等不断出现。

60年代半合成青霉素迅速发展。

70年代抗生素品种迅速发展。

50年代各国还致力于农抗的研究，找到了如杀稻瘟素、六瘟素、春日霉素、多氧霉素、有效霉素等。

到现在为止，抗生素品种非常多，有说3万、4万，也有说8万、9万的。

但在临床上应用的仅有120～350余种。

我国抗生素生产情况。

第三节抗生素的分类

从自然界获得的抗生素已达9000多种，微生物来源就有3000种以上，需进行分类。

一、根据微生物来源分类：

1．放线菌产生的抗生素；

2．真菌产生的抗生素；

3．细菌产生的抗生素；

4．动植物产生的抗生素。

二、根据抗生素的作用分类：

1．抗革兰氏阳性菌抗生素；

2．抗革兰氏阴性菌抗生素；

3．抗真菌类抗生素；

4．抗结合分枝杆菌类抗生素；

5．抗癌细胞类抗生素；

6．抗病毒和噬菌体类抗生素；

7．抗原虫类抗生素。

三、根据抗生素的作用机制分类：

1．抑制细胞壁合成的抗生素；

2．影响细胞膜功能的抗生素；

3．抑制核酸合成的抗生素；

4．抑制蛋白质合成的抗生素；

5．抑制生物能作用的抗生素。

四、根据生物合成途径分类：

（一）氨基酸、肽类衍生物：

（见书P6/1-5段）

1．简单氨基酸衍生物：

环丝氨酸、重氮丝氨酸等。

2．寡肽抗生素：

青霉素、头孢菌素等。

3．多肽类抗生素：

多粘菌素、杆菌肽等。

4．多肽大环内酯类：

放线菌素等。

5．含嘌呤和嘧啶基团的抗生素：

曲古霉素，嘌呤霉素等。

（二）糖类衍生物：

1．糖苷类抗生素；

2．与大环内酯连接的糖苷抗生素。

（三）以乙酸，丙酸为单位的衍生物。

1．乙酸衍生物：

四环类，灰黄霉素等。

2．丙酸衍生物：

红霉素等。

3．多烯和多炔类抗生素：

制霉菌素、曲古霉素等。

五、根据化学结构分类：

1．β－内酰氨类；

2．氨基糖苷类；

3．大环内酯类；

4．四环类；

5．多肽类：

多粘菌素、杆菌肽、放线菌素等；

6．多烯类：

制霉菌素、两性霉素B、球红霉素、曲古霉素等；

7．苯烃基胺类：

氯霉素、甲砜氯霉素等；

8．蒽环类：

罗红霉素、阿霉素、正定霉素；

9．环桥类：

利福霉素等；

10．其它类。

第四节抗生素的应用

一、抗生素剂量表示法

1．折算重量单位：

规定能抑制50ml标准肉汤的葡萄球菌为一个单位。

1u＝0.6ug青霉素G.Na盐；1mg青霉素G.Na＝1667u

（1mg青霉素GNa可抑制83300ml肉汤中的葡萄球菌。

）

2．重量单位：

以抗生素活性部分为一个单位：

如庆大霉素碱1mg＝1000u.

3．类似重量单位：

以特定纯粹盐为重量单位：

如盐酸金霉素1mg＝1000u.

4．特定单位：

制霉菌素1mg＝3000u杆菌肽1mg＝55u.

二、抗生素在医疗上的应用

三、抗生素在农业和畜牧业上的应用

第五节抗生素研究的范畴及趋向

一、生物学和生物化学方向的研究

1．新抗生素筛选

2．选育高产菌株

3．抗生素合成机理的研究

4．抗生素作用机理（机制）

二、化学方面的研究

1．抗生素化学性质与结构

2．抗生素结构改造

3．抗生素化学检定方法

4．抗生素生产、应用的劳动保护和三废处理

三、生化工程方面的研究

第六节抗生素工业生产概况

抗生素工业生产是生物工程和化学工程融合而成的新的学科。

1．特点：

纯种发酵、需氧发酵、次级代谢产物（无法从投料计算）、有效成份低，而且不稳定。

2．生产工艺过程：

菌种→孢子制备→种子→发酵→提取→精制→成品检验→包装→分装→（应用→跟踪→质量分析）

第一章思考题

1．抗生素的定义。

2．抗生素有哪几种分类法，各有什么特点，举例简要说明。

3．抗生素剂量表示法有哪几种，举例说明。

4．医用抗生素应具备的条件是什么？

5．抗生素工业生产有什么特点？

6．抗生素一般生产过程如何？

hgx5182003-10-1711:

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第一部分抗生素生产工艺

第二章菌种选育及菌种保藏

第一节菌种选育的理论基础

一、微生物的遗传和变异

遗传与变异是自然现象，又是客观规律。

点突变

基因突变

遗传（型）变异：

遗传物质决定（DNA或RNA）染色体畸变

变异基因重组

表型变异：

环境因素

二、基因突变

基因突变类型

三、基因重组（generecombination）

指两个或多个不同性状个体的遗传基因转移到一个体细胞内，经重新组合后，造成菌种变异，形成新的遗传型个体。

基因重组

第二节菌种选育的经典方法

一、经典法

二、诱变剂

1．物理诱变剂

2．化学诱变剂（参见书P27及《工业微生物育种》）

3．生物诱变剂：

温和噬菌体

第三节现代菌种选育技术

一、杂交育种：

指两个基因型不同的菌株通过接合使遗传物质重新组合，再从中分离，筛选出具有新性状的菌株。

一般包括以下过程：

标记菌株的选择→异核体的形成→杂合二倍体的形成→重组体的转化→重组体遗传性状的分析

二、原生质体融合

亲本A→标记→原生质体A

混合→原生质体融合→融合子捡出→融合子分析

亲本B→标记→原生质体B

三、基因工程

1．目的基因的准备

2．载体系统

3．基因与载体连接

4．转化

5．重组体的筛选和表达产物的鉴定

四、新抗生素产生菌的获得

1．传统：

土壤中放线菌、真菌、细菌。

2．趋势：

稀有放线菌，海洋微生物，极端环境微生物，人工改造获得微生物。

第四节菌种保藏

1．定期移植保存法

2．液体石蜡封藏法

3．真空冷冻干燥保藏法

4．液氮超低温保藏法

5．沙土管保藏法

6．麦皮保藏法

第三章培养基

第一节培养基成分及其功能

一、碳源：

提供微生物生长繁殖所需的能源和构成细胞的碳骨架。

1．碳水化合物：

单糖，多糖，多聚糖（为葡萄糖，蔗糖，淀粉等）

2．脂肪

3．有机酸（CH3COONa＋2O2→2CO2+H2O+NaOH）

二、氮源：

构成菌体细胞物质，提供N原素

1．无机氮源：

如NH4Cl、（NH4）2SO4、NH4NO3、（NH4）3PO3等（快速利用N源）。

2．有机氮源：

花生饼粉，黄豆饼粉，玉米浆，玉米;白粉，蛋白胨，酵母膏（慢速利用氮源）。

酵母膏→B因子→使阻断菌恢复产生抗生菌（利福霉素）的能力

（NH4）2SO3→2NH3+H2SO3

NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH

三、无机盐、微量元素：

P、S、Mg、Fe、K、Na、Cu、Zn、Mn等。

四、水：

①构成生物体的成分；②培养基的组成部分；③参与代谢反应；

④作为代谢反应介质；⑤作为物质传递介质；⑥良好的热导体。

五、生长因子及其主要功能

生长因子：

维生素，氨基酸，嘌呤和嘧啶等。

1．维生素：

是辅酶的组成成分；

2．氨基酸：

有些生物不能合成某种氨基酸；

3．嘌呤和嘧啶：

构成核酸和辅酶。

六、前体及其主要功能

能被微生物直接利用，以构成次级代谢产物结构的一部分，而其本身结构没有大的变化，这种物质称为前体。

如：

苯乙酸及其类似物是青霉素G的前体；苯氧乙酸是青霉素V的前体；氯化物（NaCl）是金霉素的前体；肌醇是链霉素的前体；正丙醇，丙酸是红霉素的前体等。

前体虽然能大大提高次级代谢产物的产量，但往往对菌体有毒性，在应用时应特别注意。

七、诱导物或刺激剂：

能诱导或刺激某种物质的产生或大大提高其产量的物质。

如：

β－吲哚乙酸是金霉素生物合成的刺激物；甲硫氨酸和亮氨酸是头孢菌素的刺激剂；

丙氨酸和异亮氨酸是阿弗米丁的刺激剂；巴比妥是链霉素、利福霉素等的刺激剂；

B因子（3‘―磷酸丁酰―腺苷）能刺激利福霉素产生菌生产能力成倍增长。

八、抑制剂及其主要功能

在次级代谢产物发酵生产过程中，往往抑制某一代谢途径，就会使另一代谢途径活跃。

如溴化物抑制了金霉素的产生，从而减少金霉素的含量，提高四环素的含量；加入二乙基巴比妥盐可抑制利福霉素B以外其他利福霉素的生成，从而增加利福霉素B的含量和产量。

第二节培养基的种类

一、按来源分类：

二、按状态分类：

三、按用途分类：

第三节影响培养基质量的因素

一、原材料质量的影响：

玉米浆、黄豆粉、花生饼粉、蛋白胨、淀粉、糊精、CaCO3等因品种、产地、加工方法、储藏条件等的不同均有可能造成质量上出现较大的波动。

二、水质的影响

深井水、地表水、自来水、蒸馏水等的水质有极大的不同。

它们随地质（地区）（地貌）、季节、处理方法和环境的变化而变化。

自来水是发酵工业的主要用水，而自来水厂水质处理所用的漂白粉、沉淀剂、消毒剂等往往造成水质的较大波动。

三、灭菌操作

葡萄糖与含氨基的物质反应形成→5－羟甲基糖醛和棕色的类黑精（焦化）对微生物有一定的毒性。

磷酸盐与Ca2+、Mg2+、NH4＋等反应形成沉淀或络合物。

四、培养基粘度的影响

粘度是培养基物性的重要指标之一，它直接影响氧的传递、营养成分、无机盐、生长因子等的扩散，从而影响细胞的呼吸、营养成分的吸收，最终导致影响目标产物的形成。

第四节培养基配置的原则

一、碳氮源种类的确定原则

快速利用碳氮源、慢速利用碳氮源的种类配比要满足不同微生物，不同生长阶段和生产阶段的需要。

二、碳氮源比例的确定原则

斜面便于长孢子，种子利于长菌丝；发酵前期利于长菌丝，中后期利于合成和积累目标产物。

此外C/N比等应与环境因素结合考虑，为对溶氧条件较好的设备，对通气较足的配置可采用菌丝较浓的C/N比。

对溶氧较差、通气不足的设备可采用菌丝较稀的C/N比。

三、培养基配置与pH之关系原则

酸性抗生素发酵环境一般呈酸性（低于pH7），中性及碱性抗生素发酵环境一般呈中碱性（pH>=7）。

因此在配置培养基时，生理酸碱性原料应合理搭配。

四、保证源副材料质量的稳定性原则

定点采购、定点加工、稳定加工工艺、恒定的贮存条件、再配合预试验来保证大工艺的稳定。

hgx5182003-10-1711:

54

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第四章灭菌及染菌防治

第一节对数残留定律

一、对数残留定律

湿热灭菌时，培养基中微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比：

式中：

N—菌的残留个数

—为灭菌时间（秒）

k—为速率常数（1/秒）

Ns一般取0.001（即1000次灭菌有一次失败的机会）

如N0＝2×107个/ml时，60m3罐装40m3料，求

121℃时，k取0.027（1/秒）

二、培养基灭菌温度的选择

培养基破坏为热分解反应，属于一级反应动力学；

式中：

C为反应物浓度（克分子/升）

为反应时间（秒）

k’为化学反应速率常数（1/秒）（随温度及反应种类而变）

在化学反应中，其他条件不变，则反应速率常数和温度的关系可用阿累尼马斯方程式表示：

培养基：

R＝1.987卡/°k?

克分子（气体常数）

灭菌速率常数：

式中：

E’＝卡/克分子（活化能）

T＝绝对温度°K

或R＝8.313J/mol?

k

△E’＝J/mol

T＝绝对温度°K

A为比例常数

灭菌时：

（K1为温度T1时的灭菌速率常数）

（K2为温度T2时的灭菌速率常数）

以上两式相除：

；————————①

同时培养基破坏也可得出：

————————②

①除以②得：

∵灭菌活化能E大于培养基成分破坏的活化能E’，即E>E’

∴大于

即随着温度的上升，灭菌时速率常数的增加倍速大于培养基破坏的速率常数增加的倍速。

因此有认为高温灭菌优于低温灭菌之说。

一般E’≈2,000~20,000（卡/克分子）

E≈50,000～100,000（卡/克分子）

注：

枯草杆菌FS5230的k≈0.047~0.063s－1;

梭状芽孢杆菌PA3679的k≈0.03s－1;

嗜热脂肪芽孢杆菌FS1518的k≈0.013s－1

嗜热脂肪芽孢杆菌FS617的k≈0.048s－1

第二节发酵设备灭菌

一、实罐灭菌：

1．预热（80～90℃）

2．直热（蒸汽）（120℃、30min）（全进全出原则）

3．待空气压力高于罐内压力时，通入空气。

（即待罐内压力降到低于空气压力后导入无菌空气。

）

二、空罐灭菌：

130℃，45～60min，直接蒸汽法。

冷却系统水应排净（夹套与盘管）。

三、连续灭菌：

配料（预热）→连消塔→维持罐→冷却管→无菌培养基。

四、空气过滤除菌

五、发酵染菌的原因分析及防治措施

1．渗漏；

2．空气系统；

3．输料（物料）系统（种子带菌、补料带菌）；

4．灭菌系统（料结快导致消不透等）；

5．操作系统（倒压、死角等）。

第五章发酵过程控制

一、碳源浓度变化及其控制

1．一般控制法：

决定补糖的参考参数有：

糖的消耗速率、pH变化、菌体浓度、菌丝形态、发酵液粘度、溶解氧浓度、消沫油使用情况、罐内发酵液实际体积等。

补糖方式：

连续滴加、少量多次、大量少次等。

2．动力学模型控制法：

需建立动力学模型，在实际生产上应用较少（略）。

二、氮源浓度变化及其控制

对每一种微生物，其生长期和生产期均有较合适的氮浓度要求。

控制氮源浓度一般以氮基氨作为指标。

但确定最佳氮浓度几乎是不可能的，因为即使是同一菌种，不同批次、不同时间，均有不同的最佳点。

生物发酵绝对的重复性难以获得，因此也就不存在最佳氮浓度。

但工艺控制的目的是使氮源等趋于最佳化。

趋于最佳化是工艺技术追求的目标，是永恒的主题，也是难题。

较合理的氮浓度是在实际中采集，而不是人为创造的。

从最好的生产批号中不断分析总结出合理的氮源浓度，然后人为创造条件，以满足生产的需要。

补充氮源分为补充方式与补碳源类似，以达到最佳生产为目标。

三、补无机盐、前体

补无机盐，一般以磷酸盐、硫酸盐、铵盐等较常见，CaCO3也是发酵中常用的盐，但单一补充CaCO3的较少。

无机盐有生理酸碱性之分，不仅可以作为微量元素，又可作为C、N源，还可以调节pH，改善发酵环境，是一个非常灵活的发酵中间调控物质，赋予了发酵工艺（程）的深刻奥秘，应在实际工作中灵活应用。

前体能大大提高发酵水平，但前体一般对生长不利，应把握补加的时间和数量，特别是浓度的控制，否则将适得其反。

四、溶氧浓度的变化和控制

1．溶氧浓度变化规律

D0

t

2．（发酵异常时）溶氧变化

①染好气性杂菌

②染噬菌体

③呼吸减弱

④菌丝自溶

⑤设备故障（加油失灵、空气过滤器堵塞等）

3．溶氧控制

①加大通气量

②适当降低温度

③提高压力

④补水

⑤条件许可情况：

提高搅拌转速，特别是实验小罐。

思考：

以上哪一种方法最好？

补水最好。

五、温度控制

温度控制的选择：

一般来说，生长温度与生产温度控制有所差别。

不同温度将引起向不同的生物合成方向发展。

因此，在发酵工艺控制上对温度的掌握也要引起注意。

通常情况下，在不影响生物合成方向改变的情况下，高温有利于生长，低温有利于生产，但并不绝对。

六、pH控制

应知道：

无机酸碱调节pH最方便、省事，但也是最无奈的办法。

生理酸碱性物质调节pH最困难，不易把握，但只要对症，效果最佳。

七、泡沫控制

泡沫大都是由蛋白质等易起泡的成份所引起。

正常起泡：

1．前期：

由于营养成份丰富而起泡，这类泡沫只要菌丝迅速生长，泡沫自然消除。

2．末期：

细胞自溶而起泡，预示着应尽快放罐。

异常泡沫：

1．前期长时间泡沫不能下降，说明菌体可能不能正常生长，应在促进生长上解决问题，若在消泡上下功夫，将导致更不好的后果，这种情况下，应以人工消泡为主。

2．中期起泡，预示着异常发酵的出现，处理方法将视具体情况而定。

消沫剂在发酵工程是不可缺少的控制剂，但应越少越好，不可盲目使用，否则，其作用是相反的。

八、发酵终点的判断

1．单位不长；

2．NH2-N回升；

3．C点较低；

4．泡沫回升；

5．菌丝出现空泡、衰老。

九、发酵异常处理

1．发酵液较稀：

（染噬菌体除外）菌丝溶解快于生长，可补天然丰富氮源，减少油、消泡剂、前体等的补加。

（补种）

2．发酵液过浓：

补水（同时要注意渗透压等变化对生长和生产的影响）。

3．糖耗过慢：

补P，补N源，升温，补种等。

4．pH异常：

污染、补生理酸碱性物质。

hgx5182003-10-1712:

03

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第二部分抗生素

第七章β-内酰胺类抗生素

第一节β-内酰胺类抗生素概述

一、特性

二、命名

青核→青霉烷酸→6-氨基青霉烷酸→青霉素G（苄青霉素）→Na盐、K盐

头核→头孢霉烷酸→7-氨基头孢霉烷酸→头孢菌素C

三、物理性质

β-内酰胺环：

伸缩震动频率，由振动频率分析其结构稳定性。

头孢菌素C在260nm处有一吸收峰。

（特征）

立体结构

β-内酰胺环的反应性能。

（归理化性质讲）

第二节青霉素理化性质

旋光性：

pK值2.76（25℃），可与NEP（N-乙基六氢吡啶）成盐而从溶媒中析出。

（可算特征反应，但青霉素X除外。

）

青霉素族抗生素：

加工成普鲁卡因青霉素或苄星青霉素（二苄基乙二胺，长效）。

单位表示法：

1667μ/mg（理论值），1μ=0.5999...（0.6）ug.

一、稳定性

1．稳定：

纯净干品相当稳定，150℃1.5hr效率不降。

青G、Na、K、普，有效期三年。

pH=6~6.5最稳定（以5~7为好）；在非极性溶媒中稳定；在缓冲力强溶液中稳定。

2．不稳定：

归降解反应讲。

（过酸过碱、热等均不稳定。

）

二、溶解度

1．青霉素盐在极性溶剂中溶解度大。

（水中>20mg/ml）

2．青霉素游离酸在非极性溶剂中溶解度大。

若非极性溶媒含水量上升，青霉素碱金属盐溶解度大大上升。

三、紫外光谱

青G：

在252、257、264nm处有弱吸收峰，是侧链苯乙酰胺基引起的。

是杂质，因此优级品规定在处不得高于0.05。

四、降解反应

1．在β-内酰胺酶及碱性作用下→青霉噻唑酸

2．在酸（性）作用下→β-内酰胺环破裂

青霉烯酸青霉酸→异青霉酸

（噁唑酮：

320nm）

（COOH）

3．酸性水解的最终产物：

SRCONHCH2CHO青霉醛（酸）

RCONH＋2H2O＋

NCOOHH＋/100℃（CH3）CSHCHCOOH青霉胺

ONH2

＋

CO2

4．高度真空下，分子重排形成青霉咪唑酸：

S

RCONHCHCHS

RCONC

NCOOH

OCH2NCOOH

C===O

青霉咪唑酸

5．青霉素酰胺酶（大肠杆菌产生）—→6-氨基青霉烷酸。

重要的半合成中间体。

RCONH-CHCOOH（α-酰胺基丙二酸）

6．碱性水解生成青霉噻唑酸—→→青霉胺酸COOH

7．青霉素与羟胺（NH2OH）—→氧肟酸—→铁盐紫色复合物

SSS

RCONHNH2OHRCONHRCONH

NCOOHONHCOOHNHCOOH

ONHOHONHC

Fe3＋O

紫色复合物

五、过敏反应（放概述中讲）

综合以上的反应特性。

测定青霉素的方法有：

1．碘量法；

2．比色法：

与羟胺反应生成氧肟酸进而与高价Fe3＋形成紫色复合物；

3．光密度法；

4．生物法；

5．HPLC法等。

第三节青霉素生产（菌种与发酵）

一、菌种：

选育得到高产株。

孢子颜色特征：

黄绿、绿、蓝绿

产黄青霉

国内：

大多数生产厂都采用绿孢子丝状菌。

细胞生长发育：

分为6期：

Ⅰ－Ⅲ长菌丝为主；

Ⅲ－Ⅴ产单位为主；

Ⅵ放罐。

（NH4）2SO4→2NH3＋2H＋＋SO42－（NH4）2HPO4→2NH3＋H