编译：微科盟如风，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

导读  

母乳喂养深刻地塑造了婴儿的肠道微生物群，这对生命早期的免疫发育至关重要，而且肠道微生物群可以通过各种方式影响宿主的生理状况，例如通过代谢过程产生代谢产物。然而，目前很少有研究关于依赖母乳的微生物代谢产物介导宿主-微生物群的相互作用。在本研究中，我们证明母乳促进的双歧杆菌Bifidobacterium通过一种之前未被识别的芳香乳酸脱氢酶（ALDH）将芳香氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸）转化为各自的芳香乳酸（吲哚乙酸、苯乳酸和4-羟基苯乳酸）。我们使用单克隆小鼠证实了双歧杆菌Bifidobacterium将芳香族氨基酸转化为其乳酸衍生物的能力。我们对丹麦婴儿（n = 25）从出生到6月龄的粪便微生物群组成和代谢组的纵向分析表明，粪便中的芳香乳酸浓度与含有ALDH的人乳寡糖降解双歧杆菌Bifidobacterium的丰度呈正相关，包括长双歧杆菌Bifidobacterium longum、短双歧杆菌B. breve和双歧杆菌B. bifidum。我们进一步证明，粪便中双歧杆菌Bifidobacterium产生的吲哚乙酸的浓度与这些样品在体外激活芳烃受体（AhR）的能力有关，芳烃受体是控制肠道稳态和免疫应答的重要受体。最后，我们表明，吲哚乙酸通过作为AhR和羟基羧酸受体3（HCA3）的激动剂，以剂量依赖的方式调节人类CD4+T细胞和单核细胞的体外免疫反应。我们的发现揭示了母乳促进的双歧杆菌Bifidobacterium在婴儿的肠道中产生芳香乳酸，并提示这些微生物的代谢物可能影响生命早期的免疫功能。本文研究结果有可能为个体生命早期（婴儿）阶段开发增强机体免疫系统的新型靶向疗法奠定基础，同时研究者也有望开发出一些支持性策略来帮助儿童机体发展出平衡的肠道菌群，从而促进机体免疫系统的良性发展。

论文ID

原名：Bifidobacterium species associated with breastfeeding produce aromatic lactic acids in the infant gut

译名：与母乳喂养有关的双歧杆菌在婴儿肠道中会产生芳香乳酸

期刊：Nature Microbiology

IF：17.745

发表时间：2021年10月21日

通讯作者：Tine R. Licht, Henrik M. Roager

通讯作者单位：丹麦技术大学国家食品研究所，丹麦哥本哈根大学

DOI号：10.1038/s41564-021-00970-4

实验设计

结果

1 双歧杆菌Bifidobacterium与婴儿肠道中的芳香乳酸相关

为了探索生命早期母乳喂养状态、肠道微生物组成和芳香族氨基酸代谢之间的相互作用，我们使用16S核糖体RNA扩增子测序来推断肠道微生物群组成，并使用靶向超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）代谢组学方法来量化来自SKOT I 队列的59名健康丹麦婴儿的粪便样本中的19种芳香族氨基酸及其衍生物（补充表1和2）。纳入SKOT I的婴儿是足月出生的，抽样时为9.1±0.3（平均±标准差）月龄，40.7%的婴儿仍为部分母乳喂养（补充数据1a、b）。根据母乳喂养状态（部分母乳喂养与断奶）对9个月大的婴儿进行分层后，加权 UniFrac 距离的主坐标分析 （PCoA） 显示第一个PC轴上有显著的的分离（r2 = 0.093，P < 0.001，Adonis检验；图1a），这反映了双歧杆菌相对丰度的梯度增加（r2 = 0.397，P < 0.001，Adonis 检验；图1b）。其他元数据（年龄、性别、分娩方式、当前配方奶粉摄入量和引入固体食物的年龄）并不能解释与母乳喂养状态相同程度的肠道微生物群变化（r2 < 0.05，P > 0.03，Adonis检验；补充数据1c）并且根据这些参数，没有细菌属有显著差异（FDR 校正的P > 0.1，Mann-Whitney U检验；补充数据1d）。粪便芳香族氨基酸代谢物浓度的主成分分析（PCA）（补充数据1e）也表明母乳喂养状态导致了少量的分离，这主要是由3种芳香族乳酸、4-羟基苯基乳酸（4-OH-PLA）、苯基乳酸（PLA）和吲哚乳酸（ILA）驱动的（图1c）。相关性分析显示，除吲哚醛（IAld）外，双歧杆菌与粪便中所有3种芳香族乳酸（4-OH-PLA、PLA和ILA）的浓度显著相关（图1d和补充数据1f）。在母乳喂养的婴儿中富含的双歧杆菌Bifidobacterium（扩展数据图1a和补充数据1g），即长双歧杆菌B. longum、双歧杆菌B. bifidum和短双歧杆菌B. breve与粪便中芳香乳酸（4-OH-PLA，PLA和ILA）和 IAld（图1e中的聚类1）有正向关联，但与粪便中的芳香族丙酸、芳香族氨基酸的浓度呈负相关，与芳香族乙酸的浓度相关性较小（图1e中的第2组）。相比之下，断奶后的双歧杆菌Bifidobacterium，包括青春双歧杆菌B. adolescentis、动物双歧杆菌/假长双歧杆菌B. animalis/pseudolongum和链状双歧杆菌组B. catenulatum，与芳香乳酸和母乳喂养状态均无显著相关性（图1e）。这些关联与母乳喂养婴儿粪便中3种芳香乳酸浓度高于断奶婴儿粪便中的观察结果一致（扩展数据图1b）。此外，婴儿尿液中3种芳香族乳酸的丰度（补充图1-3）显示出与母乳促进的双歧杆菌Bifidobacterium的相对丰度类似的正相关（扩展数据图1c）。此外，粪便和尿液中ILA的水平呈正相关（ρ = 0.68，P < 0.0001），表明粪便中该代谢物的水平是系统性的。与断奶婴儿相比，母乳喂养婴儿的尿液中 ILA 丰度始终显著高于PLA和4-OH-PLA（扩展数据图1b）。总之，这表明特定的双歧杆菌Bifidobacterium在婴儿肠道中产生芳香乳酸（图1f）。

图1 母乳喂养与9月龄婴儿的粪便微生物群组成和芳香族氨基酸代谢物有关。a,b，基于来自参与SKOT队列的9月龄婴儿粪便样本的OTU加权 UniFrac距离的PCoA图（n = 59）。a，样本根据母乳喂养状态着色，椭圆表示部分母乳喂养（红色，n = 24）和断奶（蓝色，n = 35）婴儿数据点的80%置信区间 （CI）。b，样品根据双歧杆菌属Bifidobacterium的相对丰度着色。c，SKOT粪便样本中芳香族氨基酸及其衍生物浓度（nmol g–1粪便）的PCA图，根据母乳喂养状态着色，椭圆表示母乳喂养（红色，n = 24）和断奶数据点的80% CI（蓝色，n = 35）婴儿。负载（变量和主要成分之间的相关性）用箭头显示，并显示了芳香族氨基酸 ILA、4-OH-PLA 和 PLA 的注释。d，热图说明了双歧杆菌Bifidobacterium相对丰度与SKOT粪便样本中芳香族氨基酸及其衍生物浓度之间的Spearman 等级相关系数（双侧检验）（n = 59）。e，热图说明了SKOT粪便样本中不同双歧杆菌Bifidobacterium物种的相对丰度和选定的微生物衍生的芳香族氨基酸分解代谢物之间的Spearman等级相关系数（双侧检验）的分层聚类（右侧的树状图）（n = 59 ）。箱线图显示双歧杆菌Bifidobacterium属物种的相对丰度（线，中位数；方框，四分位距（IQR）；须，最小到最大），根据母乳喂养状态分层，统计显著性由双侧Mann-Whitney U检验测定。f, 肠道微生物的芳香族氨基酸分解代谢途径（修改自Smith和Macfarlane、Smith和Macfarlane以及Zelante等人）。对于所有图形，星号表示统计显著性：*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001 和 ****P < 0.0001。

2 双歧杆菌在体外产生芳香乳酸 

为了确认在婴儿中检测到的双歧杆菌Bifidobacterium产生芳香乳酸的能力，双歧杆菌型菌株Bifidobacterium在含有所有3种芳香氨基酸的培养基中进行厌氧生长，葡萄糖或HMO作为唯一碳水化合物来源。对培养上清液的分析表明，ILA、PLA 和 4-OH-PLA 主要由双歧杆菌B. bifidum、短双歧杆菌B. breve、长双歧杆菌B. longum ssp. longum、长双歧杆菌婴儿亚种B. longum ssp. infantis 和B. Scardovii产生（图2a）。根据在9月龄婴儿中观察到的关联（图1e），其他双歧杆菌Bifidobacterium，即青春双歧杆菌Bifidobacterium、B. animalis ssp. lactis、B. animalis ssp. animalis、齿双歧杆菌B. dentium、链状双歧杆菌B. catenulatum、假链状双歧杆菌B. pseudocatenulatum 和B. pseudolongum ssp. pseudolongum，只产生少量的代谢物（图2a）。双歧杆菌Bifidobacterium产生高水平芳香乳酸的能力通常与使用HMO作为碳水化合物来源的能力一致（图2a），表明母乳促进的双歧杆菌与芳香乳酸的产生之间存在联系。在任何培养上清液中均未检测到芳香乳酸的下游产物（图1f）。

图2 双歧杆菌Bifidobacterium通过ALDH产生芳香族乳酸。a，双歧杆菌Bifidobacterium菌株在含有2%（w/v） 葡萄糖或HMO混合物作为唯一碳水化合物来源的改良MRS培养基 （MRSc）中体外生产ILA、PLA 和4-OH-PLA。对于青春双歧杆菌Bifidobacterium、B. animalis ssp. animalis、B. animalis ssp. lactis、齿双歧杆菌B. dentium、链状双歧杆菌B. catenulatum，使用HMO作为碳水化合物来源时，没有观察到生长或生长非常差（OD600nm< 0.4）。显示了3个生物学重复的平均值。b，双歧杆菌型菌株Bifidobacterium中所有基因的邻接系统发育树，注释为LDH编码基因（ldh）。这4个集群被指定为类型1-4。c，用缺乏（空载体）或含有来自B. longum ssp. infantis DSM 20088的4型ldh（Type4_ldh+）的诱导型载体转化的大肠杆菌E. coli LMG194 细胞产生ILA、PLA和4-OH-PLA，通过在LB培养基中添加L-阿拉伯糖和补充芳香族丙酮酸（吲哚丙酮酸、苯基丙酮酸和 4-羟基苯基丙酮酸）诱导基因表达5 h后的情况，条形显示平均值 ± s.d.，有3个生物学重复。d，长双歧杆菌B. longum ssp. longum 105-A （WT）的生长曲线，其同基因插入4型  ldh 突变体（Type4_ldh 突变体）和与 4 型ldh基因互补的4型 ldh 突变株（互补）。曲线显示3个生物学重复的平均值± s.d.，倍增时间报告为平均值± s.d.。e，野生型、Type4_ldh突变体和早期稳定期培养物中补充菌株的ILA、PLA、4-OH-PLA和乳酸的产生，如d所示。条形显示3个生物学重复的平均值± s.d.。通过单因素方差分析one-way ANOVA评估统计显著性。ND表示未检测到。

3 识别起作用的ALDH

由于有报道称乳杆菌属Lactobacillus中的乳酸脱氢酶（LDH）可以将苯丙酮酸转化为 PLA，因此我们假设双歧杆菌属Bifidobacterium中存在相应的酶。在本研究中包括的双歧杆菌Bifidobacterium菌株中注释为ldh的所有基因的比对和系统发育分析揭示了4个聚类（图2b）。尽管所有双歧杆菌Bifidobacterium基因组都包含负责将双歧杆菌果糖6-磷酸分流中的丙酮酸转化为乳酸的ldh（此处指定为1型ldh），但某些物种具有额外的ldh，此处分别指定为2型、3型和4型。与体外发酵结果一致（图2a），所有显著的芳香族乳酸产生双歧杆菌Bifidobacterium物种都包含4型ldh，表明它可以编码一种以前未被识别的ALDH。对所有可用的全基因组测序双歧杆菌Bifidobacterium菌株的进一步分析表明，4型ldh普遍存在于长双歧杆菌 B. longum、双歧杆菌B. bifidum、短双歧杆菌B. breve 和B. scardovii 菌株中（补充表3）。有趣的是，双歧杆菌菌株Bifidobacterium的基因组分析显示，4型ldh基因是包含氨基酸转氨酶基因（怀疑负责将芳香族氨基酸转化为芳香族丙酮酸）和卤酸脱卤酶基因的遗传元件的一部分（有未知重要性）（补充图4），已表明其构成短双歧杆菌B. breve 中的操纵子。从长双歧杆菌婴儿亚种B. longum ssp. infantis （DSM20088）的典型菌株中克隆4型ldh基因，转化到大肠杆菌Escherichia coli中的载体显示，4型ldh基因的表达确实导致培养上清液中PLA、4-OH-PLA和ILA的出现（图2c）。为了验证双歧杆菌Bifidobacterium物种中4型ldh 依赖性芳香乳酸的产生，我们通过长双歧杆菌B. longum ssp. longum 105-A（补充图5）同源重组产生了4型ldh 插入突变菌株。这是一种含有4型ldh的遗传可控菌株（补充图6a）。105-A菌株的4型LDH氨基酸序列与长双歧杆菌B. longum ssp型菌株中的同源物具有 >98%的同一性。双歧杆菌B. bifidum、短双歧杆菌B. breve和B. scardovii（补充图6b）具有>91%的同一性，但通过BLAST分析没有发现非双歧杆菌同源物（氨基酸序列同一性截断值60%）。在含有3种芳香族氨基酸的培养基中培养野生型（WT）、4型ldh突变株和互补的4型ldh突变株证实，4型ldh的破坏并不损害在富培养基中的生长（图2d）。ILA、PLA和4-OH-PLA在WT和互补的4型ldh突变体菌株的上清液中积累，但不在4型ldh突变体中积累（图2e）。重要的是，4型ldh突变体在将丙酮酸转化为乳酸的能力方面没有明显减弱（图2e），支持4型ldh在转化芳香丙酮酸中的独特作用。此外，为了证明芳香乳酸在体内的生产，我们用WT或4型ldh突变株对无菌小鼠进行了单克隆，发现与4型ldh突变株相比，它们在WT中的浓度增加了20-60倍（扩展数据图2）。重组4型LDH酶的纯化和表征表明它的质量为33.9 kDa（补充图7a），而通过尺寸排阻色谱估计天然分子质量为71.9 kDa，表明在溶液中形成了二聚体（补充图7b）。不添加金属离子或添加乙二胺四乙酸（EDTA）不会降低酶活性，最佳pH值为8.0-8.5，酶在37°C时最稳定（补充图7c-e）。果糖1,6-二磷酸酯（1型LDH的变构效应物）和芳香族氨基酸合成的几种中间体均未观察到异养效应（补充图8）。然而，我们发现磷酸盐起到了积极的作用，表明4型LDH是一种细胞内酶（补充图9a，b）。在不同磷酸盐浓度下进行的测定显示4型LDH是K型变构酶（补充图9b）。根据对4型ldh突变体观察到的未受损乳酸生成（图2e），芳香族丙酮酸底物的催化速率（kcat）是中等到高的，但丙酮酸催化速率非常低（图3）。通过高效液相色谱（HPLC）验证了从各自的芳族丙酮酸底物产生ILA、PLA和4-OH-PLA（补充图9c）。在100 mM磷酸盐存在下，该酶对吲哚丙酮酸显示出最高的亲和力（最低K0.5），但对4-羟基苯基丙酮酸显示出最高的催化速率（图3）。然而，吲哚丙酮酸的催化效率（kcat/K0.5）最高（194 s-1 mM-1），其次是4-羟基苯基丙酮酸（16 s-1 mM-1）和苯基丙酮酸（11 s-1 mM-1），表明吲哚丙酮酸的偏好。观察到的所有底物的Hill系数 （nH = 1.0–1.4） 表明在测试条件下具有弱的正协同性。总的来说，这些结果表明，4型ldh基因（从现在起称为aldh）编码的ALDH负责在与母乳喂养相关的双歧杆菌Bifidobacterium物种中产生ILA、PLA和4-OH-PLA。

图3 双歧杆菌ALDH（4型LDH）的动力学特征。a-d，为吲哚丙酮酸 （a）、苯基丙酮酸 （b）、4-羟基苯基丙酮酸 （c） 和丙酮酸 （d） 获得的4型LDH的底物饱和曲线。动力学参数是通过将两个独立的实验数据曲线拟合到Hill方程来计算的，显示在插图中。反应在100 mM磷酸盐存在下进行。

4 双歧杆菌Bifidobacterium物种在婴儿早期控制芳香乳酸谱

为了研究婴儿早期双歧杆菌Bifidobacterium物种建立和芳香乳酸的动态变化，我们建立了哥本哈根婴儿肠道（CIG）队列，其中包括25名健康母乳喂养或混合喂养的婴儿，从出生到6月龄期间，每2-4周采样一次（补充数据2a、b）用于微生物组分析（补充数据2c和扩展数据图3）和包括芳香族乳酸在内的靶向代谢物定量研究（补充表4和补充数据2d）。特定受试者的肠道微生物群谱揭示了高度个性化的物种组成（扩展数据图3c 和扩展数据图4a）。正如一个主要包含阴道产、母乳喂养婴儿的队列所预期的那样，肠道微生物群以双歧杆菌为主（平均64.2%），并且前十大主要分类群主要是长双歧杆菌B. longum（38.5%）、短双歧杆菌B. breve（9.1%） , 双歧杆菌B. bifidum （7.9%）, 链状双歧杆菌B. catenulatum group （6.4%） 和齿双歧杆菌B. dentium （1.7%）（扩展数据图3a,b），剩下的是B. Scardovii （0.24 %）、青春双歧杆菌B. adolescentis（0.15%） 和动物双歧杆菌/假长双歧杆菌B. animalis/pseudolongum（0.10%）（补充数据2e）。使用Bray-Curtis差异的PCoA揭示了基于5种主要双歧杆菌物种即长双歧杆菌B. longum、双歧杆菌B. bifidum、短双歧杆菌B. breve、链状双歧杆菌B.catenulatum group和齿双歧杆菌B. dentium的相对丰度，在样本之间进行了群落分离（图4a和扩展数据图4b-f）。长双歧杆菌B. longum、双歧杆菌B. bifidum和短双歧杆菌B. breve的群落丰度与测量的芳香乳酸粪便浓度相匹配（图4b），但不包括链状双歧杆菌组B. catenulatum group和齿双歧杆菌B. dentium（图4a）。基于定量 PCR （qPCR） 估计所有样本的总细菌负荷，我们计算了16S rRNA扩增子数据集中每个细菌分类群的绝对丰度，并将婴儿型双歧杆菌Bifidobacterium物种定义为长双歧杆菌B. longum、双歧杆菌B. bifidum、短双歧杆菌B. breve和B. Scardovii的总丰度。我们观察到从出生到大约6月龄时，婴儿型双歧杆菌Bifidobacterium的绝对丰度显著增加，与此同时，粪便中ILA、PLA和4-OH-PLA的浓度逐渐增加，HMO残留物的丰度降低（扩展数据图5）。我们通过调整受试者和年龄的线性混合模型证实，Bifidobacterium的绝对丰度与粪便中ILA、PLA 和4-OH-PLA的水平呈正相关，另外与粪便中HMOs残留物丰度呈负相关（图4c）。在检测到的所有细菌分类群中，长双歧杆菌B. longum、双歧杆菌B. bifidum、短双歧杆菌B. breve与粪便中ILA、PLA和4-OH-PLA的水平相关性最强（补充数据2g）。当使用重复测量相关性系数（扩展数据图6）和使用Spearman等级相关性系数（扩展数据图7）在每个采样点的个体之间分析时，这些关联在个体中也很明显。此外，在扩增子序列变异（ASV）水平重新上分析微生物组数据显示出非常相似的结果（扩展数据图8a）。最后，qPCR靶向检测长双歧杆菌B. longum ssp. longum、B. longum ssp. infantis、短双歧杆菌B. breve和双歧杆菌B. bifidum证实了芳香乳酸和HMO的关联（扩展数据图8b）。值得注意的是，我们发现双歧杆菌B. bifidum的两个亚种都与芳香乳酸有关，但主要是长双歧杆菌婴儿亚种B. longum ssp. Infantis、双歧杆菌B. bifidum与粪便中的HMO残留有关（扩展数据图8b）。为了进一步证实我们关于早期生活的相关性和母乳喂养的影响，我们从98对瑞典母婴的粪便样本中挖掘了一个已发表的宏基因组数据集，以寻找包含aldh基因的双歧杆菌宏基因组组装基因组（MAGs）。该分析显示，纯母乳喂养（与混合喂养或配方奶喂养相比）4月龄的婴儿和部分母乳喂养（与断奶相比）12月龄的婴儿中含有aldh的MAGs丰度显著更高（扩展数据图9）。此外，我们发现母亲体内含aldh的MAGs丰度非常低，而婴儿在引入固体食物后（4月龄对比12月龄），这些MAGs显著下降。因此，我们建立了母乳喂养、HMOs降解、特定双歧杆菌物种丰度和婴儿早期芳香族乳酸浓度之间的联系。

图4 Bifidobacterium决定婴儿早期粪便中的芳香乳酸浓度。a,b，Bray-Curtis计算差异的PCoA图（n = 234 （i）），根据参与CIG队列的婴儿粪便中双歧杆菌Bifidobacterium （a）的相对丰度或芳香族乳酸（ILA总和）的log10-转化浓度（nmol/g feces）（PLA和4-OH-PLA） （b）进行着色。虚线圆圈包括由长双歧杆菌B. longum、双歧杆菌B. bifidum、短双歧杆菌B. breve和齿双歧杆菌B. dentium占主导的群落（相对丰度 >50%）（青春双歧杆菌B. adolescentis、B. Scardovii和动物双歧杆菌/假长双歧杆菌B. animalis/pseudolongum群落从不占主导地位；扩展数据图3和4）。（i）由于读取计数低（ 总群落的1%）和ILA、PLA和4-OH-PLA在CIG队列中选定个体的粪便中的浓度。细菌计数值