1.3 仪器

ECO-170P-230型细胞培养箱（美国NBS公司）；RXL2001型荧光显微镜（德国Leica公司）；Allegra 64R型低温高速离心机、EPICS-XL型流式细胞仪（美国贝克曼公司）；GIS-2019型凝胶成像系统（天能科技有限公司）；DYY-7C型电泳仪（北京六一仪器厂）；MoODEL680型酶标仪（美国NBS仪器设备公司）。

1.4 数据库与软件

UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）；TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）；微生信网站（www.bioinformatics.com.cn）；GeneCard数据库（https://www.gene cards.org/）；DAVID 6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov）；RCSB PDB数据库（https://www.rcsb.org）；STRING数据库（http:// string-db.org/）；Cytoscape 3.9.1软件；Venny2.1软件；PyMoL2.4.0软件；Autodock Tools1.5.7软件。

2方法

2.1网络药理学分析

2.1.1 防己生物碱类活性成分及靶点筛选采用TCMSP数据库分析防己生物碱类活性成分以及作用靶点，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥20%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.10作为筛选标准，得到符合条件的防己生物碱类单体，使用Uniprot数据库进行基因注释，得到活性成分ID、名称等数据；通过SwissTargetPrediction在线预测防己生物碱类单体的作用靶点，再利用Cytoscape 3.9.1软件对数据进行可视化处理，形成“成分-靶点”网络。

2.1.2 乳腺癌阿霉素耐药靶点的获取在GeneCards数据库上搜集乳腺癌阿霉素耐药（breast cancer adriamycin resistance）疾病靶点，设置关联度≥20，利用Venny 2.1软件对疾病-药物靶点取交集，得到84个交集靶点。

2.1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建及核心靶点筛选采用STRING11.5数据库，导入交集靶点，物种设定为 “Homosapiens”，置信度设定为≥0.700，隐藏孤立蛋白，导入Cytoscape 3.9.1软件，运用CytoNCA插件进行网络拓扑学分析，以点度中心性、介度中心性、接近中心性≥所有节点的中位数为标准筛选核心蛋白。

2.1.4 交集靶点的基因本体（gene ontology，GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析采用DAVID 6.9数据库，导入获得的交集基因，物种设定为“Homosapiens”，根据FDR≤0.05，通过生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3个层次对基因功能分析得到结果，将数据载入到微生信网站使其可视化。

2.1.5 “防己生物碱类成分-靶点-通路”网络构建采用Cytoscape 3.9.1软件，构建“防己生物碱类成分-靶点-通路”网络。

2.1.6 分子对接验证将分析得到的防己生物碱类活性成分与核心靶点进行分子对接验证。首先在TCMSP数据库下载活性成分2D结构的sdf格式文件，在RCSB数据库下载核心靶点蛋白3D结构pdb格式文件。进一步使用Autodock Tools 1.5.7对蛋白和成分数据进行加氢、除水等处理并保存为pdbqt格式，采用PyMoL2.4.0进行结果的可视化。

2.2实验验证

2.2.1CCK-8实验检测防己生物碱类活性成分对MCF-7细胞、MCF-7/ADR耐药细胞的增殖抑制作用取对数生长期的MCF-7、MCF-7/ADR细胞，以2×10 4个/mL接种于96孔板，每孔100 μL，培养24 h后，分别加入100 μL不同浓度（1、2、4、8、16、32 μmol/L）的N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱、甜菜碱，对照组加入不含药物的培养基，设置6个平行孔。将96孔板放入培养箱培养48 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养2 h，采用酶标仪检测各孔吸光度（A）值，计算抑制率。

抑制率＝( A 实验－A空白)/( A 对照－A空白)

2.2.2倒置显微镜、荧光显微镜观察防己生物碱类活性成分对MCF-7、MCF-7/ADR细胞形态的影响取对数生长期的MCF-7、MCF-7/ADR细胞，以3×10 4个/mL接种于6孔板，培养24 h后，MCF-7细胞分别加入N-甲基毛果芸香碱（14 μmol/L）、光千金藤碱（14 μmol/L）、粉防己碱（13 μmol/L）、甜菜碱（22 μmol/L），MCF-7/ADR细胞分别加入N-甲基毛果芸香碱（15 μmol/L）、光千金藤碱（17 μmol/L）、粉防己碱（14 μmol/L）、甜菜碱（25 μmol/L），对照组加入不含药物的培养基。培养48 h后，采用倒置显微镜进行拍照。每孔加入1 mL多聚甲醛固定1 h后，弃去废液，冲洗后加入200 μL Hoechst 33258染色液，水浴加热30 min后取出，采用荧光显微镜进行拍照。

2.2.3流式细胞仪检测防己生物碱类活性成分对MCF-7、MCF-7/ADR细胞凋亡的影响取对数生长期的MCF-7、MCF-7/ADR细胞，以3×10 4个/mL接种于6孔板，培养24 h后，按“2.2.2”项下方法进行给药，培养48 h后，弃去培养基，胰酶消化收集细胞。加入70%冰乙醇，固定24 h后离心，800 μL加入Annexin V和碘化丙啶（PI）染液孵育，用尼龙网将染色后的细胞滤过，采用流式细胞仪检测。

2.2.4防己生物碱类活性成分对MCF-7、MCF-7/ ADR细胞Caspase-3、MAPK1、HSP90AA1、PIK3CA蛋白表达的影响取对数生长期的MCF-7、MCF-7/ ADR细胞，以3×10 4个/mL接种于6孔板，培养24 h后，按“2.2.2”项下方法进行给药，培养48 h后，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，裂解30 min，收集细胞离心15 min。取上清液煮沸使蛋白变性，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭2 h后加入一抗，4 ℃孵育24 h后，洗膜；加入二抗，孵育2 h后，洗膜，加入化学发光试剂并用显色仪拍照。

2.2.5统计学分析用SPSS 21.0软件进行统计分析，数据以表示，多样本均数比较采用One-way ANOVA分析。

3 结果

3.1防己生物碱类活性成分及靶点筛选

通过TCMSP数据库以OB≥20%、DL≥0.10作为筛选标准，得到4个符合条件的防己生物碱类单体见表1。

利用 SwissTargetPrediction在线预测4种生物碱单体的作用靶点，共得到332个靶点。通过Cytoscape 3.9.1软件，对数据进行可视化处理分析，并构建“成分-靶点”网络（图1）。

3.2乳腺癌阿霉素耐药靶点的获取

在GeneCards上搜集乳腺癌阿霉素耐药疾病靶点，设置关联度≥20，得到490个靶点。其中防己生物碱类4个单体的作用靶点与疾病靶点存在84个交集靶点（图2）。

3.3PPI网络的构建及核心靶点筛选

利用STRING 11.5数据库，导入交集靶点，获得PPI网络（图3-A）。采用Cytoscape 3.9.1软件、CytoNCA插件进行网络分析，并且将点度中心性、介度中心性、接近中心性≥所有节点的中位数设定为筛选标准，筛选得到7个核心靶点（图3-B），分别为蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、HSP90AA1、原癌基因SRC、PIK3CA、Caspase-3、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、MAPK1。

3.4GO功能及KEGG通路富集分析

通过DAVID 6.9数据库对防己生物碱类活性成分和疾病的交集靶点进行GO功能富集分析，设定FDR≤0.05，共获得GO功能590条，其中435条BP、64条CC、91条MF。选取前10的条目通过微生信网进行可视化分析，见图4-A。

通过DAVID 6.9数据库对防己生物碱类活性成分和疾病的交集靶点进行KEGG通路富集分析，设定FDR≤0.05，得到148条通路，选取前20的条目通过微生信网进行可视化分析，见图4-B。结果表明，防己生物碱类活性成分与乳腺癌阿霉素耐药密切相关的信号通路为钙信号通路、环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）-cGMP依赖性蛋白激酶（cGMP dependent protein kinase，PKG）信号通路、Apenlin信号通路、维甲酸诱导基因-I（retinoic acid-inducible gene-I，RIG-I）样受体信号通路等。

3.5“防己生物碱类活性成分-靶点-通路”网络的构建

将防己生物碱类活性成分、核心靶点、KEGG富集分析富集度前20的通路导入Cytoscape 3.9.1软件绘制“防己生物碱类活性成分-靶点-通路”网络图，见图5。

3.6分子对接验证

以N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱、甜菜碱为配体，Caspase-3、AKT1、MAPK1、HSP90AA1、PIK3CA、EGFR、SRC为受体，利用Autodock Tools1.5.7软件，进行分子对接，结果显示，小于−4 kJ/moL的占53.57%，除EGFR和粉防己碱外，其余成分与受体间结合能均小于0 kJ/moL。各成分与AKT1、Caspase-3、HSP90AA1、MAPK1、PIK3CA、SRC、EGFR显示良好的结合活性。其中N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱以及甜菜碱与Caspase-3结合活性最好，对接演示见图6。

3.7防己生物碱类活性成分对MCF-7、MCF-7/ ADR细胞增殖的影响

如图7所示，N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱和甜菜碱对MCF-7、MCF-7/ADR细胞均具有增殖抑制作用。根据给药浓度和抑制率进行线性回归，计算N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱和甜菜碱对MCF-7细胞的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC 50 ）分别为14.77、14.47、13.95、22.08 μmol/L，对MCF-7/ADR细胞的IC 50 分别为15.13、17.33、14.20、25.15 μmol/L， 说明这4种生物碱能够逆转乳腺癌MCF-7/ADR耐药细胞的耐药性，后续实验剂量参考IC 50 值进行设定，MCF-7细胞的给药剂量为N-甲基毛果芸香碱14 μmol/L、光千金藤碱14 μmol/L、粉防己碱13 μmol/L、甜菜碱22 μmol/L，MCF-7/ADR细胞的给药剂量为N-甲基毛果芸香碱15 μmol/L、光千金藤碱17 μmol/L，粉防己碱14 μmol/L、甜菜碱25 μmol/L。

3.8 防己生物碱类活性成分对MCF-7、MCF-7/ ADR细胞形态的影响

采用倒置显微镜、荧光显微镜观察N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱、甜菜碱对MCF-7、MCF-7/ADR细胞形态的影响，如图8所示，防己生物碱类活性成分可以明显改变MCF-7、MCF-7/ADR细胞的形态，并且出现部分细胞变圆漂浮现象；荧光显微镜下各给药组细胞出现凋亡小体，且细胞膜破碎明显，细胞排列稀疏，细胞核呈现较强的荧光。

3.9 流式细胞仪检测防己生物碱类活性成分对MCF-7、MCF-7/ADR细胞凋亡的影响

如图9所示，N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱、甜菜碱诱导MCF-7、MCF-7/ADR细胞凋亡，对MCF-7细胞的凋亡率分别为（26.22± 0.47）%、（14.38±0.35）%、（28.71±0.64）%、（19.67± 0.26）%，大部分凋亡细胞处在G 1 、G 2 期，判定为早期凋亡；对MCF-7/ADR细胞的凋亡率分别为（17.94±0.29）%、（13.75±0.86）%、（21.51±0.51）%、（16.95±0.37）%，大部分凋亡细胞处在G 1 、G 2 期，判定为早期凋亡。

3.10 防己生物碱类活性成分对MCF-7、MCF-7/ ADR细胞HSP90AA1、PIK3CA、MAPK1和Caspase-3蛋白表达的影响

如图10、11所示，N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱和甜菜碱作用于MCF-7、MCF-7/ ADR细胞48 h后，HSP90AA1、PIK3CA、MAPK1蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01），Caspase-3蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）。

4 讨论

目前中药逆转乳腺癌阿霉素耐药的研究已取得了进展，但肿瘤耐药机制复杂，且中药成分众多，网络药理学在有效成分以及疾病靶点筛选得到了广泛的应用，在一定程度上可以缩小研究的范围和明确研究的目的；分子对接技术将成分靶点与疾病靶点相结合，以虚拟评价的方式验证网络药理学的预测结果。进一步采用网络药理学方法，筛选防己生物碱类活性成分逆转乳腺癌阿霉素耐药的潜在靶点及作用通路，结果发现N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱、甜菜碱4个活性成分主要作用于SRC、EGFR、HSP90AA1、AKT1、MAPK1、PIK3CA、Caspase-3 7个核心靶点。分子对接结果显示N-甲基毛果芸香碱与Caspase-3、MAPK1、EGFR、HSP90AA1、PIK3CA和SRC有良好的结合活性（结合能＜−4 kJ/moL）；光千金藤碱与Caspase-3、MAPK1和PIK3CA有良好的结合活性（结合能＜−4 kJ/moL）；粉防己碱与Caspase-3、HSP90AA1、MAPK1和PIK3CA有良好的结合活性（结合能＜−4 kJ/moL）；甜菜碱与Caspase-3、PIK3CA有良好的结合活性（结合能＜−4 kJ/moL），其中N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱以及甜菜碱与Caspase-3结合活性最好。KEGG通路富集分析结果表明，防己活性生物碱类成分可能作用于钙信号通路、cGMP-PKG信号通路、RIG-I样受体信号通路、Apenlin信号通路等通路来逆转乳腺癌阿霉素耐药。

体外实验结果显示，N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱、甜菜碱4个防己生物碱类活性成分均对MCF-7、MCF-7/ADR细胞具有增殖抑制作用，能够改变肿瘤细胞形态，诱导肿瘤细胞凋亡，进一步对关键通路节点蛋白检测发现，4种生物碱对MCF-7、MCF-7/ADR细胞HSP90AA1、PIK3CA、MAPK1、Caspase-3蛋白均具有调节作用。HSP90AA1 [18-20]、PIK3CA [22-26]、MAPK1 [27-28]是诱发肿瘤发生的标志性蛋白，这4种生物碱能够显著下调HSP90AA1、PIK3CA、MAPK1蛋白表达，说明能够抑制肿瘤细胞增殖；Caspase-3 [29-32]蛋白是肿瘤细胞凋亡的启动子，这4种生物碱能够显著上调Caspase-3蛋白表达，说明能够诱发肿瘤细胞凋亡。实验结果说明，N-甲基毛果芸香碱、光千金藤碱、粉防己碱和甜菜碱可以调控乳腺癌MCF-7/ADR细胞的Caspase-3、MAPK1、HSP90AA1、PIK3CA关键靶点，诱导细胞发生凋亡，逆转乳腺癌耐药。本研究采用网络药理学、分子对接技术和体外细胞实验明确了防己逆转乳腺癌阿霉素耐药的药效物质基础、潜在作用靶点及通路，为防己生物碱类成分逆转乳腺癌阿霉素耐药的研究奠定了研究基础，也为解决临床乳腺癌阿霉素耐药提供有效方案参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：杨 燚，王毛毛，于 淼，季宇彬，李文兰，辛国松，李海茹． 基于网络药理学、分子对接和体外实验探讨防己生物碱类活性成分逆转乳腺癌耐药的作用机制 [J]. 中草药, 2023, 54(9):2841-2851.返回搜狐，查看更多