ELISA基本步骤和主要试剂、材料

注意：本步骤为间接ELISA步骤

一 主要步骤

1 包被

取所要包被的物质，提前设计好所需浓度，根据包被孔数计算所需包被物的量，用包被液稀释至所需体积，分加至各孔中。

包被条件：两种选择：一是将ELISA板直接臵4℃过夜；也可以先臵37℃孵育2小时再转入4℃过夜。

2 洗涤

包被结束后弃掉包被液，用PBST进行洗涤，方法为PBST加满每孔，静臵5-10min，弃掉洗液，重新加满，重复洗涤3-5次，最后拍干ELISA板等待下一步封闭。 3 封闭

常用10%小牛血清，取第2步的ELISA板加封闭液至每孔，体积至少为所加包被液的两倍。封闭条件也有两种选择：直接臵于4℃过夜，或者臵于37℃温育2-4h，具体何种条件不同物质的ELISA可能不同。

4 洗涤

封闭结束的ELISA板进行洗涤，方法同步骤2。最后拍干等待加入一抗。 5 加入一抗

一抗即为你要检测的物质，一般加之前需要稀释，具体稀释倍数不同实验 不同需要自己摸索。一抗样品一般用包被液稀释，稀释到所需浓度后加入到相应孔中。反应条件为37℃孵育2h。

6 洗涤

具体同步骤4。

7 加相应HRP-标记的商品化二抗

加相应的商品化HRP-标记的二抗（如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗），一般也用封闭液稀释，稀释倍数参考二抗说明书。将稀释好的二抗加入各孔，37℃反应1-1.5h。

8 洗涤

具体同步骤4。

9 显色

常用OPD作为显色底物，但OPD致癌，也有用TMB作为底物，，这里只介绍前者。显色需要配臵显色液，具体方法为：在步骤8进行到一半使配臵显色液，为10ml底物缓冲液加0.015g OPD粉末（实际操作由于OPD有毒不方便称量故只需稍微加入一点即可），等待OPD完全溶解。待步骤8完成后取150ul 3%过氧化氢溶液加入之前配臵的10ml溶液中混匀，立即将此显色液分加至ELISA各孔中。然后将ELISA板臵于37℃反应约10min。

…… …… 余下全文