人体内胰岛素瘤相关蛋白1（INSM1）是一类含有C2H2-型的锌指（zinc finger）结构域，能够识别特定碱基序列的转录调节因子[1].锌指结构域蛋白简称锌指蛋白，由氨基酸残基与Zn2+结合形成具有指状空间构型的结构.锌指蛋白广泛存在于真核生物体中，比如人类基因组中有将近1%的基因编码锌指蛋白.锌指蛋白在细胞分化[2]、神经发育[3]和胚胎发育[4]等生命过程中有非常重要的作用，并与黑色素瘤[5]、神经细胞瘤[6]和糖尿病肾病[7]等疾病相关.INSM1最初从人的胰岛素瘤中分离鉴定，后来发现在神经内分泌系统[8]、胰腺[9]和相关肿瘤[10]中都有表达，对神经内分泌系统和胰岛的正常发育起着重要的调控作用.人体内INSM1含510个氨基酸，分子量为52.9 k.INSM1的C-端包含有5个串联的C2H2-型的锌指蛋白结构域（zinc finger 1-5，图 1）.应用PSI-BLAST进行序列比对分析（如图 1所示），发现人体内INSM1的锌指结构域与黑猩猩（Pan troglodytes）的同源蛋白的氨基酸序列相似度高达99.4%，与小鼠（Mus musculus）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）和斑马鱼（Danio rerio）的同源性分别为90.6%、55.6%和55.6%，表明INSM1的锌指结构域在物种进化过程中具有高度保守性.

目前，研究表明含有5个完整锌指结构域ZF (1-5) 的INSM1能结合序列特异性的双链DNA（TG/TC/TC/TT/AGGGGG/TCG/A）[11].然而，各个锌指结构域的结构以及识别特异性DNA的分子机制仍不清楚.为深入理解INSM1中的锌指结构域与序列特异性DNA的相互作用，我们尝试构建了包含不同锌指区间的质粒，比如ZF (1-3)、ZF (2-3) 和ZF (4-5) 等，来制备相应的锌指结构域样品.在成功克隆包含ZF (4-5) 的质粒pET-32m-INSM1(424-497) 的基础上，本文报道了对该蛋白的诱导表达和纯化，以及Zn2+对蛋白质结构域稳定性的影响.15N标记的ZF (4-5) 的核磁共振（NMR）谱图表明该结构域具有折叠的三维空间结构.本工作为后续的ZF (4-5) 结构和功能研究奠定了良好的前期基础.

采用聚合酶链反应（PCR）方法从HepG2肝癌细胞cDNA扩增出INSM1(424-497) 基因，上游引物为5'-GGATCCGGCGACGGCGAGGGGG-3'，下游引物为5'-GGATCCTATCTGTTTTCGGATGG GTGGCAC-3'.扩增条件为98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，68℃延伸30 s，共30个循环后结束反应.将N端含有His-tag（MHHHHHHSSGLVPRGS）的pET-32m (+) 载体和扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳，胶回收后用BamH I酶切.回收酶切产物，用T4连接酶连接后转化至大肠杆菌DH5a，挑取单克隆菌落，筛选阳性克隆，提取重组质粒，进行序列测定.

转化测序正确的重组质粒pET-32m-INSM1(424-497) 到大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞，挑取单菌落接种到5 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37 ℃、220 r/min的摇床中培养8 h，离心重悬后加入到100 mL M9液体培养基中，在37 ℃、220 r/min的摇床中过夜培养.将100 mL菌液全部转入到1 L的M9培养基中继续在37 ℃、220 r/min的摇床中培养至光密度值（OD）为0.6，向菌液中加入最终浓度为0.1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导，17 ℃诱导20 h收菌.ZF (4-5) 分别在传统的M9培养基和含0.25 mmol/L ZnCl2的M9培养基中进行表达，15N标记的ZF (4-5) 通过加入含0.25 mmol/L ZnCl2和15NH4Cl（购自Cambridge Isotope Laboratories, Inc.）的M9培养基表达.采用缓冲溶液[含200 mmol/L NaCl、20 mmol/L磷酸缓冲盐溶液（PBS）、0.05% β-巯基乙醇，pH 7.0]超声裂解细胞，对表达的蛋白先进行Ni2+柱（GE Healthcare）分离纯化，然后进一步经分子筛层析柱（GE Healthcare）纯化.

室温条件下在Chirascan圆二色谱（CD）仪上进行远紫外圆二色谱（Far-UV CD）实验，氮气吹扫190~260 nm波长范围，石英比色皿光程为2 mm，扫描速度为50 nm/min，扫描3次，累加求平均值.二级结构计算采用软件CDNN Program（version 2.0）.

用于NMR实验的缓冲溶液含100 mmol/L NaCl、20 mmol/L 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）、0.02% NaN3、10 mmol/L二巯基苏糖醇（DTT）、5 mmol/L CaCl2、10% D2O，pH 6.5，15N-ZF (4-5) 的浓度为0.5 mmol/L.2D 1H-15N HSQC直接维（1H）和间接维（15N）谱宽分别为9 000 Hz和18 000 Hz，两维中心分别位于δH 4.70和δN 118.0，采样数据点阵t2×t1=1 024×96，累加次数为4.2D 1H-15N HMQC直接维（1H）和间接维（15N）谱宽分别为9 000 Hz和96 000 Hz，两维中心分别位于δH 4.70和δN 200.0，采样数据点阵t2×t1=1 024×256，累加次数为64.

采用1D的1H-15N HSQC测定ZF (4-5) 中骨架的15N的纵向弛豫时间（T1）和横向弛豫时间（T2）.T1和T2测定实验各选取10个不同的弛豫恢复时间，分别为0.05 s、0.10 s、0.20 s、0.30 s、0.40 s、0.60 s、0.80 s、1.00 s、1.50 s和2.00 s（T1）；0.01 s、0.03 s、0.05 s、0.07 s、0.09 s、0.11 s、0.13 s、0.17 s、0.21 s和0.25 s（T2）.旋转相关时间（τc）计算公式如下[12]：

(1) 式中，T1和T2为ZF (4-5) 骨架15N的纵向弛豫时间和横向弛豫时间，νN为NMR实验时15N的进动频率（Hz）.

上述所有NMR实验在Bruker Avance Ⅲ 600 MHz NMR谱仪上测定，实验温度为298 K.NMR实验数据用NMRPipe软件进行变换处理[13]，采用Sparky软件进行分析[14].

图 2为蛋白质ZF (4-5) 在大肠杆菌（E.Coli.）中诱导表达和纯化的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）胶图.在M9培养基中经过IPTG诱导，仅能观察到非常微弱的蛋白质条带（-ZnCl2），表明ZF (4-5) 基本不表达.当在M9培养基中加入0.25 mmol/L的ZnCl2后，ZF (4-5) 诱导表达明显增强（+ZnCl2）.诱导表达的目标蛋白为可溶性蛋白，经过Ni2+柱和分子筛层析柱的先后纯化，蛋白产率可达20.0 mg/L.研究结果表明，外源性的Zn2+对ZF (4-5) 的诱导表达是不可缺少的.

图 3(a)为15N标记的ZF (4-5) 的2D 1H-15N HSQC谱，ZF (4-5) 浓度为0.5 mmol/L，信号累加次数为4.从图中可以观测到：（1）1H-15N交叉峰具有很高的信噪比；（2）骨架1H-15N交叉峰的数目大致与该蛋白的氨基酸数目对应；（3）交叉峰两维的展宽分别为δH6.50~10.00和δN104.0~128.0；（4）各个交叉峰的强度相对均一.实验结果表明ZF (4-5) 具有相对单一的构象和已折叠的二级和三级结构，可应用液体NMR方法解析其三维空间结构.

氨基酸序列相似性分析表明ZF (4-5) 包含两个C2H2-型锌指结构域，电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）实验（赛默飞世尔科技上海金桥实验室）进一步证实了实验表达的ZF (4-5) 中存在结合态的Zn2+（未显示的实验数据）.然而，Zn2+对ZF (4-5) 结构稳定性的影响尚需验证.首先，在15N-ZF (4-5) 中加入浓度高达10.0 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），加入过程中样品保持澄清透明，无沉淀出现.2D 1H-15N HSQC谱如图 3(b)所示，发现1H-15N交叉峰的信噪比依然很高，然而在1H和15N两维展宽程度显著降低，呈现出无规则卷曲或仅含有少量二级结构的蛋白质谱峰特征.实验结果表明过量的EDTA虽然从ZF (4-5) 中置换出Zn2+，没有直接导致蛋白的聚集沉淀，但是明显改变了蛋白质的折叠.其次，对加入过量EDTA的ZF (4-5) 样品进一步进行了CD谱分析.实验结果如图 3(c)所示，未加入EDTA的蛋白样品的Far-UV CD曲线（实线），在208 nm和222 nm附近有两个负吸收峰，该信号为α-螺旋的特征吸收峰.过量EDTA加入的样品的Far-UV CD曲线（虚线）发现前述α-螺旋的两个特征吸收峰消失，在203 nm附近出现一个更强的负吸收峰，该信号为蛋白质呈现无规则卷曲时的特征吸收峰.因此，Far-UV CD实验结果表明，当ZF (4-5) 中的Zn2+被置换后，蛋白质的二级结构发生明显改变.因此Zn2+对维持该蛋白的稳定性有着重要的作用.

蛋白质旋转相关时间（τc）可以通过其骨架15N的横向和纵向弛豫时间估计[12].研究表明，当蛋白质分子量在20 k以下时，分子量与τc呈线性相关[15].图 4(a)和4(b)分别为ZF (4-5) 的骨架15N的横向和纵向弛豫时间测量，最后计算的τc为7.3 ns.图 4(c)的相关性分析表明，ZF (4-5) 的τc所对应的分子量为9.6 k，与ZF (4-5) 单体分子量相吻合，表明该蛋白质样品在研究状态下以单体为主要存在形式.

图 1中氨基酸序列相似性分析表明，ZF (4-5) 含有两个可与Zn2+结合的C2H2-型结构域.已有研究表明，在His咪唑环中的2D 1H-15N HMQC谱中，可观测1H与15N（2JHN或3JHN）的化学位移值的大小与谱峰强度，能够区分组氨酸的两个互变异构体，即δ-/ε-的异构体[16].图 5(a)为15N标记的ZF (4-5) 的2D1H-15N HMQC谱，与Zn2+结合的4个His（H459、H464、H487和H492）咪唑环上通过2JHN或3JHN的1H-15N的交叉峰均已归属.这些交叉峰的信号模式表明这4个His都呈现为δ-异构体，即氢原子结合在δN上[图 5(b)，δ1].因此，ZF (4-5) 中的Zn2+是与εN螯合的，图 5(b)展示了C2H2-Zn2+的结合模式.

本文通过对锌指蛋白INSM1的ZF (4-5) 的诱导表达和纯化研究，得到了与Zn2+螯合的具有稳定三级结构的蛋白质样品，Zn2+对维持该蛋白结构的稳定性是必不可少的.对蛋白质样品进一步表征分析，该蛋白质在研究条件下主要呈现为单体，适合于NMR结构解析.该锌指结构域的三维空间结构及其与序列特异性的DNA结合的研究正在进行之中.