金花茶(Camellia nitidissima Chi)为山茶科山茶属多年生常绿灌木，主要分布在我国广西防城港十万大山的兰山支脉一带，有着“茶族皇后”的美称[1]，具有消炎、降压、去腻减肥、增进食欲、解酒解渴等功效[2]，于2010年被批准为新资源食品[3]，在广西、广东[4]、福建[5]等地均有人工栽培。天然金花茶多生长在较荫蔽的沟谷、林下或灌木丛中，一般在上层林冠盖度较大的阴凉环境下分布较多[6]。李辛雷等[7]认为，显脉金花茶、贵州金花茶、离蕊金花茶、常柱金花茶和直脉金花茶属中度热敏感性物种。夏秋季大棚种植易使金花茶处于40 ℃以上的高温胁迫环境，但目前对金花茶耐热性的研究相对较少。

植物耐热性的鉴定方法通常有外部形态鉴定法、微观结构鉴定法、生理生化指标鉴定法等[8]，其中，生理生化指标鉴定法因其准确、简便而成为筛选和评价耐热植物的主要方法。植物叶片的膜透性及丙二醛(malondialdehyde, MDA)、脯氨酸、可溶性糖含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)活性常作为评价植物抗逆性的指标[9]。本试验对金花茶叶片和枝条进行高温胁迫，测定其生理指标，探讨其动态变化及作为耐热生理评价指标的可行性，以期为金花茶的耐热生理机制研究及高温环境下引种栽培提供依据。

供试材料为5年生金花茶，由福建世纪金花茶科技有限公司提供。主要仪器为UV-1600紫外可见分光系统，购自天津市拓普仪器有限公司。

随机选取10棵金花茶树，剪取大小相近、完整、无病虫害的当年生春梢自顶向下数第3~4叶位的健康功能叶30片，每棵茶树取3片。将叶片用去离子水洗净并擦干，避开主动脉和边缘，均匀剪成0.5 cm2大小，备用。随机选取并准确称量0.5 g碎叶片置于小烧杯中，加入15 mL去离子水，放入真空干燥器中抽真空2次，每次8 min，使叶片沉入水底。分别在28(室温)、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃的恒温水浴中处理30 min，取出后冷却至室温，测定各处理下叶片的电导率(R)，然后放入沸水浴中15 min，冷却后测定煮沸电导率(R0)，以室温下植物叶片的电导率为对照(RCK)，计算细胞伤害率[10]。细胞伤害率/%=[(R-RCK)/(R0-RCK)]×100。每个处理测定3次，取平均值。

对平均处理温度与细胞伤害率进行Logistic方程拟合，Logistic回归方程为：y=K/(1+ae-bx)。其中，y为细胞伤害率/%，x为处理温度/(℃)，K为细胞伤害率的最大饱和容量。因本研究消除了底的干扰，故K值取100，a、b为方程的参数。将方程进行线性化处理，ln[(K-y)/y]=lna-bx, 令y1=ln[(K-y)/y]，则变成细胞伤害率转化值(y1)与处理温度(x)的直线方程[11]。通过直线回归得到lna与b值及相关系数R2，求Logistic方程的二阶导数，并令其等于零，获得曲线的拐点x=lna/b[12]，即金花茶叶片的高温半致死温度。

从12棵金花茶树中随机选取生长方向相同、长势相当的24条当年生健壮春梢(每棵树选取2条)。每个处理随机抽取4条春梢，放入1 000 mL烧杯中，加400 mL水，共6个处理。将其中3个处理置于人工培养箱中进行45 ℃高温胁迫，3个处理置于常温下作为对照(CK)，每个处理为1个重复。胁迫0、4、8、16、24 h时取样，每个枝条随机取自顶向下数第3~8叶位的叶片，剪碎混合后称量分装，采用电导率仪法[13]测定相对电导率：相对电导率/%=R/R0×100。其余样品用液氮处理后置于-70 ℃冰箱，待取样完毕后统一进行生理生化指标测定。MDA含量采用硫代巴比妥酸法[11]测定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法[13]测定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮法[11]测定；SOD活性采用氮蓝四唑光还原法[13]测定；POD活性采用愈创木酚法[13]测定。每个指标均测定3次取平均值。

采用Microsoft Excel 2010软件进行数据处理与分析。

高温胁迫使细胞膜体系受破坏，细胞膜透性增大，电解质渗出增多，电导率升高，甚至引起代谢紊乱，最终导致植物死亡。因此，不同高温下叶片的电导率可以反映植物细胞的受伤害程度。高温胁迫对金花茶叶片细胞伤害率的影响见图 1。由图 1可知，金花茶叶片细胞伤害率与处理温度之间呈典型“S”型曲线，胁迫温度为35~50 ℃时伤害率无明显升高，50~60 ℃时则随胁迫温度升高急剧上升，＞60 ℃时又趋于平缓，表明金花茶叶片在50~60 ℃之间受高温的伤害最敏感，初步判断叶片膜系统不可逆破坏的临界温度为55~60 ℃。计算各温度下细胞伤害率转化值(y1)与处理温度(x)的直线回归，得到lna=12.262，b=0.208 1，R2=0.963，求得高温半致死温度为58.9 ℃。

山茶科植物高温胁迫温度一般采用40、43、45 ℃[14-16]，本文参考前人研究的基础上，设置高温胁迫温度为45 ℃，其对金花茶生理指标的影响见图 2。由图 2可知，45 ℃高温胁迫下，金花茶叶片的相对电导率、可溶性糖含量、脯氨酸含量、SOD活性均随胁迫时间的增加呈上升趋势。其中，相对电导率从胁迫前的16.6%提高到26.2%，较胁迫初始增加了57.4%，较CK增加了38.8%；可溶性糖含量从2.6%提高到3.2%，较胁迫前增加了19.7%，较CK增加了10.34%；脯氨酸含量从25 μg·g-1提高到149 μg·g-1，较胁迫前增加了4.97倍，较CK增加了2.09倍；SOD活性从77.35 U·g-1提高到373.5 U·g-1，较胁迫前增加了3.83倍，较CK增加了1.20倍；MDA含量总体呈上升趋势，POD活性呈下降趋势，但变化均不明显。可见，相对电导率、可溶性糖含量、脯氨酸含量、SOD活性均能反映高温胁迫对金花茶叶片生理指标的影响，其中脯氨酸含量和SOD活性改变最为迅速，能更快地反映高温胁迫下金花茶的生理变化。

采用电导率法测定高温对植物的伤害是评价植物耐热性常用的方法[17]。本研究表明，随着胁迫温度的升高，金花茶叶片细胞伤害率呈现“慢—快—慢”的增长趋势，为典型“S”型曲线；金花茶高温半致死温度为58.9 ℃，表明金花茶有一定的高温适应性。郭亚男等[18]测得的金花茶叶片高温半致死温度为46.3 ℃，低于本研究结果，可能由于其研究样品为1年生金花茶幼苗叶片，且处理时间均为2 h，而本研究样品为5年生金花茶叶片，处理时间为0.5 h。由此可见，高温半致死温度受植物生长状态及处理时间的影响，不一定能真实反映其在自然环境下的极限温度，但可作为耐热性的重要参考指标，可根据测定结果推测其适应的栽培环境，减少人工栽培的盲目性。

脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，能够增强细胞的抗脱水能力以及蛋白质间的水合作用，保持细胞膜结构的完整性[19]。因此，许多植物在受到逆境胁迫时都能积累高水平的脯氨酸。SOD具有清除自由基、维持细胞膜稳定性的功能[20]。本研究表明，金花茶叶片的相对电导率、可溶性糖含量、脯氨酸含量、SOD活性均随胁迫时间的延长呈上升趋势，其中脯氨酸含量和SOD活性对高温胁迫反应较敏感，可作为金花茶对热胁迫的较好指标。有报道指出，脯氨酸可作为芍药[21]、草坪草[22]、茄子[23]等的耐热性鉴定指标；SOD活性可作为黄瓜[24]、水稻[25]、小白菜[26]等的耐热性鉴定指标。金花茶叶片在45 ℃高温胁迫24 h内，MDA含量无显著增加，推测金花茶对短期高温胁迫具有一定的耐受性，这可能与脯氨酸含量和SOD活性的快速提高有关。王国霞等[27]对高温胁迫下25个油茶品种的渗透调节物质进行研究，发现可溶性糖的增加速度大于游离脯氨酸，而本研究中金花茶脯氨酸增加速度远大于可溶性糖，表明不同物种对高温胁迫的反应不同。韩冬等[28]研究发现，高温胁迫初期茶树叶片SOD活性显著增加，但随着胁迫时间的延长活性呈下降趋势，而本研究仅进行了24 h的高温胁迫，SOD活性是否随着胁迫时间延长而下降，还有待进一步研究。