酵母双杂交技术理论原理(适合科研小白阅读) |
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双杂交技术是研究蛋白与蛋白互作的技术。 涉及到的理论知识 转录/转录因子/结构域的独立性/双杂交法 转录过程 真核生物RNA的转录在细胞核内进行的,蛋白质的合成则是在细胞质中进行的。 转录起始包含了许多蛋白质-蛋白质之间的相互作用,这些蛋白质也就是结合在增强子上的转录因子以及在启动子上所装配的基础转录装置,如RNA聚合酶等。 转录因子(transcription factor,TF): 转录因子是一群能与基因5'端上游特定序列专一性结合,从而保证目的基因以特定强度在特定时间与空间表达的蛋白质分子。 (转录因子用于识别基因的启动子区域,激活mRNA的表达) 我们可以将转录因子分为作用相反的两类:正激活物和负阻遏物。 在真核生物中,正向控制的转录因子中,有一类称为真激活因子(true activator)。 真激活因子是一种经典的转录因子,它可与启动子上的基础装置发生直接的接触而发挥功能,这种方式或者是直接的,或者是通过辅激活因子而间接发生。 激活因子的结构域性质: 如下图所示,激活因子通常具有分开的结构域,它们分别结合DNA并激活转录。当它与另一类型的结构域连接在一起时,每个结构域可作为一个单独的模块而独立发挥作用。而整体转库复合体的结构特征必须要转录激活域和基础转录装置相联系,而不管结合DNA的结构域的确切定位和取向。 激活因子示意图Q:图片和图片上一段话要表达什么意思呢? A:即转录因子中,DNA结合域、激活域是相互独立的,但在一条途径中是有联系的,它允许转录激活和基础转录装置相互作用,而这种作用于DNA结合域的取向和具体定位无关。 Q:一般,想要激活转录,一个先决条件就是与DNA结合(有例外的)。那活化作用依赖于特定的DNA结合域吗? A:无关紧要。 因为DNA结构域的功能是将转录激活域带到启动子中的基础转录装置上,而精确知道如何结合、结合位置等是不需要的,只要它能在那里存在,转录激活就会发生作用,所以,DNA结合位点的精确位置可以不同。 因为对连接域无要求 ,所以我们拥有了双杂技术的理论依据: 双杂交法(研究蛋白质-蛋白质互作) 理论依据:上文所介绍的结构域独立模型 注:DBD:DNA结合域 AD:转录激活域 结构域独立模型双杂的技术手段: 我们将某转录因子分拆开为DNA结合域BD和转录激活域AD两部分, 我们将其中一个待测蛋白质融合到DNA结合域(BD),将另一个蛋白质融合到转录激活域(AD)。如果这两个蛋白质可相互作用,那么这两个融合蛋白就会相互作用。 ∴ 诱饵蛋白+BD 猎物蛋白+AD 如上图所示,通过融合技术,我们得到融合蛋白,使得一些蛋白质有DNA结构域,另一些含有转录激活域。 技术优势:它仅需要两个被测蛋白就能相互作用,而不需要任何与转录有关的东西。(因为DNA结合域和转录激活域是独立的,所以我们需要的就是把它们放在一起就好啦。) 核系统酵母双杂交技术(Two-hybrid system ,Y2H) 酵母双杂分子机制图即利用真核模式生物酵母,在其体内研究两个蛋白质之间的相互作用。 这里用到了酵母细胞中的转录因子GAL4 转录因子GAL4酵母文库中的转录因子GAL同样也包括DNA结合结构域(BD)和转录激活结构域(AD)。 BD用于识别基因的启动子区域,AD用于激活mRNA的表达。 BD和AD同时存在,才会起到转录因子的功能 ,单独存在则无作用。 结构示意图我们将已知蛋白称作Bait,即诱饵蛋白。利用诱饵蛋白找寻可以相互作用的蛋白(猎物蛋白Prey)。 酵母双杂的技术手段:我们将GAL4分拆开为BD和AD两部分 ∴ 融合蛋白1:诱饵蛋白+BD 融合蛋白2: 猎物蛋白+AD 如果诱饵蛋白和猎物蛋白进行结合,则 BD 、AD也会碰面(形成一个大的融合蛋白)激活下游报告基因的转录。 如下图,在酵母的细胞核中,这个大融合蛋白靠GAL4的BD部分去识别酵母细胞基因组上的启动子,靠AD部分激活基因的转录,从而产生一个可识别的信号 诱饵蛋白和猎物蛋白相结合Tip: 我们放进酵母细胞里的不是蛋白,而是含待测蛋白基因的质粒。 即构建两个质粒 , 如下图: 2个质粒分别包括诱饵蛋白+GAL4BD基因、猎物蛋白+GAL4AD 基因∴要导入两个质粒:一个含有BD 、诱饵蛋白基因(Bait) ;一个含有AD、猎物蛋白基因(Prey) 如下图,最终表达出来的是两个融合蛋白。一个是BD蛋白+诱饵蛋白,一个是AD蛋白+猎物蛋白 理解重点: 机制示意图Q:那我们如何看出来两个蛋白相互作用呢? A:通过我们的报告基因打报告~ 含GAL4DNA结合域BD的诱饵蛋白Bait可结合报道基因,而报道基因上含有一个简单的启动子,它包含了此DNA结合域的靶位点,但它自身不能激活这个基因。只有第一个与第二个融合蛋白结合,把转录激活域AD(带着我们的猎物蛋白Prey)带到启动子后才能激活这个基因。 GAL4技术分子机制示意图Q:酵母细胞中的报告基因有哪些? 与大肠杆菌采用抗生素筛选的策略不同,酵母系统常采用营养标记作为报告基因。 常用的报告基因有AbAr 、HIS3、URA3 、LacZ和ADE2等,对应的宿主菌则是相应标记的缺陷型细胞,必须要在含有该营养标记的培养基中生长。 eg: GAL4系统中的酵母菌种经过基因改造后既不能产生GAL4,又不能合成亮氨酸(LEU)、色氨酸(TRP)、组氨酸TRP)、腺嘌呤(ADE),因此,酵母在缺乏这些营养的培养基(SD-LEU-TRP-HIS-ADE,四缺)上无法正常生长。只有当有相互作用的蛋白存在时,激活报告基因的表达,从而通过功能互补,能够在不含营养标记的培养基中生长,以此验证是否存在相互作用。同样的,也可以通过显色反应进一步确认是否有相互作用。 ***共总结出三类报告基因供筛选 酵母双杂筛选互作蛋白1.营养缺陷筛选型(上文举过例子了) 酵母细胞培养在培养基上,可以少放营养成分 原理:如果营养成分缺失,GAL4转录因子无法存活。 但如果诱饵蛋白和猎物蛋白可以结合,组合成一个完整的转录因子后,这个转录因子会去激活合成这些营养成分的氨基酸去表达,让酵母细胞自给自足,可以存活。 2.抗性筛选 我们在培养基里加入Aba 等有毒物质 但如果诱饵蛋白和猎物蛋白可以结合,组合成一个完整的转录因子后,这个转录因子会去降解这些毒性成分,酵母可以存活。 3.蓝白斑筛选 在培养基中加入X-α-gal ,这个成分在自然状态下是无色的,但如果诱饵蛋白和猎物蛋白可以结合,组合成一个完整的转录因子后,这个基因会催化X-α-gal发生转化,会将酵母变成蓝色。 ∴经过多筛,能存活,且成蓝色的酵母,里面会有诱饵蛋白和猎物蛋白真正的结合 酵母双杂交技术的优点: 1.高敏感性 即便诱饵/猎物蛋白表达量很低,但是,检测的结果是表达产物的累计效应(人话:让酵母多长一会儿,增加表达量),可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用 2.真实性 在活的酵母细胞内表达,蛋白是天然表达的,所以真实 3.简捷性 融合蛋白相互作用后,不需要去制备抗体、纯化蛋白等步骤 4.广泛性 采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构件cDNA文库,能分析不同蛋白质的互作 酵母双杂交技术的缺陷: *假阳性 可能原因: *诱饵蛋白或猎物蛋白有自激活的功能,或诱饵蛋白或猎物蛋白与酵母中其他蛋白相互作用 *诱饵蛋白或猎物蛋白可能与酵母的DNA序列结合 ,出现假阳性结果 *假阴性 *在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质会带来毒性作用,从而影响菌株生长及报告基因的表型(即其他物种的蛋白对酵母细胞有毒性) eg:在培养基中加入的Aba 、3-AT对酵母有影响 酵母双杂交技术的局限性 *如果某些哺乳动物细胞蛋白质是经过翻译后加工才能相互作用,则该系统也不适用。因为叫酵母的后加工系统与哺乳细胞后加工系统不尽相同。 *因为高等动植物的转录翻译的调控复杂,如在蛋白形成后会经过一系列复杂的修饰,如乙酰化、泛素化、磷酸化等,如果酵母的蛋白加工中没有这些,则筛选不到互作的蛋白了 *需要诱饵蛋白和猎物蛋白基因进入细胞核内,因而不能被转运到细胞核内的蛋白质如细胞质蛋白、细胞膜蛋白的与研究就不适合 需要用膜系统的酵母双杂交技术 膜系统酵母双杂交技术(浅谈) 膜系统分子机制图膜系统(Dualsystemd split-ubiquitin ) Ubiquitin ,即泛素蛋白,可以介导蛋白质的降解 。 和核系统类似:泛素蛋白由两个关键结构域组成:C端结构域和N端结构域。只有两端都存在才能使泛素蛋白发挥作用 Ubiquitin诱饵蛋白+C端 猎物蛋白+N端 泛素蛋白有连接一个转录因子LexA-VP16。 这个泛素蛋白完整结合后,首先会将这个转录因子切掉,如下图。 膜系统酵母双杂机制示意图转录因子会进入细胞核内进行表达,发出信号。这个转录因子具有识别结构域LexA 和激活结构域VP16 转录因子LexA-VP16膜系统技术原理: 诱饵蛋白和猎物蛋白虽然自身不能进入细胞核,但是泛素蛋白自身结合后,会切割掉LexA-VP16转录因子 ,去进入核内发出信号 *做膜系统酵母双杂时,要进行蛋白质跨膜方向的预测,这个影响到我们需要选择的质粒类型 对文库类型的选择取决于蛋白质的位置 诱饵蛋白位于细胞核-------核系统 诱饵蛋白定位于细胞膜 1.N端或C端任意一端或者两端位于胞内选择膜系统 2.蛋白两端均在胞外需进行功能域预测,根据跨膜结构进行部分切除后,选择膜系统或核系统 诱饵蛋白定位于细胞质------核、膜系统均可 Q:那么怎么知道我要的这个蛋白位于细胞核、细胞膜还是细胞质呢? 方法一:做个实验:亚细胞定位实验 在细胞中表达诱饵蛋白,在诱饵蛋白上添加一个信号:绿色荧光蛋白/黄色荧光蛋白,通过观察荧光在细胞内的分布来判定该蛋白位于细胞什么位置上 方法二:理论预测 使用网站---粘贴诱饵蛋白序列--看位置 |
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