四链螺旋结构的核酸称为G-四链体(G-quadruplex)，与经典的DNA双螺旋结构明显不同．4个鸟嘌呤碱基通过Hoogsteen氢键配对形　成正方形的G平面(G-tetrad)，适当体积的阳离子或配体可以促使多个G平面堆叠形成G-四链体结构[1]．研究发现，G-四链体在生物体内普遍存在，并参与基因复制与重组、端粒延伸、基因表达调控等多种生物学过程[2]，它不仅与细胞衰老、凋亡、免疫系统功能等密切相关，也参与肿瘤和基因疾病的发生[3, 4]．已知一些配体(ligands)，如可与G-四链体特异性识别并结合的Telomestatin、TMPyP4、BRACO-19、RHPS4等，以G-四链体为靶点，通过稳定G-四链体结构或促进G-四链体的形成进而抑制癌细胞的增殖[5, 6]．近年来，G-四链体与配体作用的研究也是肿瘤治疗和防治的热点研究之一.

G-四链体与配体的相互作用研究依赖于高分辨、高灵敏的技术和方法．圆二色谱(CD)、荧光光谱(FS)、荧光共振能量转移(FRET)、核磁共振(NMR)、X-射线衍射(X-ray)、表面等离子体共振(SPR)、电喷雾质谱(ESI-MS)、毛细管电泳(CE)等是G-四链体结构及与配体相互作用研究的主要方法．本文综述了上述方法的具体应用，并对各种方法进行了比较． 1　G—鄄四链体研究的生物学意义

G-四链体结构最初都是在体外环境(in vitro)中发现的，如端粒末端的DNA重复序列或其他富含G的寡核苷酸，在一些含阳离子如K+、Na+、NH4+的缓冲溶液中经过变性和退火的处理可自发形成G-四链体结构[7, 8]．随着X-射线、核磁共振、分子荧光、全组基因分析等方法的应用，进一步发现G-四链体广泛存在于生物体内(in vivo)的DNA和RNA中[2, 3, 9, 10, 11, 12]．不仅是在染色体DNA末端的端粒区[13, 14]，在原癌基因的启动子区[15, 16]，信使RNA的5′端非翻译区(5′-UTR)[17]等都能够形成G-四链体　结构．

G-四链体结构在维护基因稳定、保持端粒长度、调控基因转录与翻译表达以及基因重组等生命过程中都具有很重要的作用[18, 19, 20, 21, 22]．例如真核生物体内的端粒酶能够延长因细胞分裂增殖而逐渐缩短的端粒，具有保持基因完整性的功能[23, 24]．研究发现，正常体细胞中端粒酶的活性受到严格的调控，分化成熟后的体细胞其端粒酶活性逐渐消失，细胞进而停止分裂，但85%以上具有持续增殖能力的癌细胞依然具有端粒酶活性[25, 26]．端粒区域DNA形成的G-四链体结构能够阻断端粒酶对端粒的延伸，进而抑制癌细胞的持续增殖[27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35]，因此G-四链体可作为癌症治疗的靶点．研究还发现端粒区域G-四链体的形成与解开与细胞周期进程相对应[29, 36],这提示G-四链体参与基因复制的过程．启动子区域的G-四链体结构能够调控基因的表达，Verma等[37]研究发现在人肿瘤细胞中加入一种能够稳定G-四链体结构的配体TMPyP4，超过60%的基因表达发生显著变化．原癌基因c-MYC启动子区域的一段核酸酶超敏区控制着c-MYC基因85%～90%基因的转录．Grand等[15]研究发现，该区域在体外环境下能够形成G-四链体结构，使用碱基置换的方法破坏该区域G-四链体结构的形成能够上调c-MYC基因的表达，而加入能够稳定G-四链体结构的配体分子则下调该基因的表达．RNA区域形成的G-四链体结构调控基因的表达通常发生在翻译过程而不是在转录过程，信使RNA 5′端非翻译区形成的G-四链体结构能够阻碍核糖体与mRNA的识别，进而导致翻译过程停止，造成基因表达下调[17, 20, 38]．G-四链体可能与人类的多种基因疾病有关，如脆性X染色体综合征和沃纳综合征．正常生物体内G-四链体结构的折叠和解开受到严格的调控，一旦该调控机制被打破，基因的　稳定性和完整性将受到威胁，甚至会导致细胞的　凋亡[4]．

由此可见，对G-四链体结构、生物学功能、调控机理等问题的基础研究非常有意义，它不仅有助于进一步揭示基因代谢和疾病发生的机理，也为多种基因疾病的治疗提供新线索和思路． 2　与G-鄄四链体作用的配体

肿瘤细胞端粒末端区域以及c-myc、c-kit等原癌基因启动区域可形成G-四链体结构[15, 16]．一些能与G-四链体结合的配体，可稳定G-四链体结构或促进G-四链体结构的形成，进而抑制端粒酶的活性以及癌基因的表达．因此G-四链体可作为肿瘤治疗的靶点．

G-四链体具有特殊的拓扑学结构，与其结合的配体通常具有平面π电子离域体系或带有局部的正电荷，这些配体分子主要有：大环类(macrocycles)、多聚芳香非环化合物(polyaromatic Non-Cyclic systerms)和金属复合物配体(metal complexs)[39]等．三类配体的结构如图 1．大环类配体多为多聚芳香环化合物，如卟啉(porphyrines)[40]、酞菁(phthalocyanines)[41]等的衍生物，它们具有平面环合的π电子离域体系，可以插入到相邻两个G平面进而稳定四链体结构．卟啉衍生物TMPyP4是第一个报道的可稳定G-四链体的配体[42]．至今报道的最有效的端粒酶抑制剂则是从链霉菌(streptomyces anulatus)中提取出的天然代谢产物Telomestatin．它是一种多聚杂环化合物，在无阳离子存在时，也能稳定G-四链体结构，其对分子内G-四链体结合的选择性较对双链DNA的识别高出70倍[43, 44]．

多聚芳香非环化合物，如吖啶(acridines)、蒽醌(anthraquinones)、二萘嵌苯(perylene)、喹啉(quinoline)等衍生物与G平面有很强的π-π堆积作用．由于吖啶、蒽醌衍生物也能插入双链DNA的碱基对间，故对G-四链体的选择性较低．但也有研究证实，该类化合物的多取代衍生物也可以作为四链体的稳定剂以及端粒酶的抑制剂，如三取代吖啶化合物BRACO-19可稳定四链体结构[45]，且可抑制端粒酶活性并在人体移植瘤细胞中表现出抗癌活性[46]．该类配体中的二萘嵌苯衍生物通过π-π堆积作用以及与DNA沟(groove)间的静电作用稳定G-四链体结构．研究发现喹啉衍生物RHPS4也是很强的端粒酶活性抑制剂，长期暴露在低浓度的RHPS4下，细胞会出现不可逆的生长停止和端粒损伤[47, 48]．进一步研究发现，RHPS4结合G-四链体可使端粒保护蛋白POT1脱离，进而使端粒酶功能丧失，而过表达POT1或TRF2则可减轻RHPS4诱导的端粒损伤[32]．除此，有文献报道RHPS4还可降低脑瘤细胞的增生能力[49]．Wu等[50]研究发现喹叨啉(Quindoline)衍生物能够与血管内皮生长因子启动子区域的富G序列作用，并抑制血管内皮生长因子蛋白的转录和表达．

金属离子与带有离域π电子的平面型分子配体配位可形成金属复合物配体，因金属离子的吸电子效应使π电子的离域范围扩大，复合物配体与G平面的π-π作用增强，故金属复合物配体表现出更强的G-四链体稳定作用[51, 52, 53, 54]．金属-卟啉复合物(metal-porphyrin complexes)是研究报道的第一类G-四链体金属复合物配体，Dixon等[55]的研究表明二价锰离子卟啉化合物对人端粒末端序列 5′-AG3TTAG3TTAG3TTAG3-3′形成的G-四链体具有很高的亲和性，其与G-四链体结合的选择性是与双链DNA结合的1000倍．镍、铜、锌、铂、金、钌[56, 57]等金属离子也能形成此类复合物． 3　相互作用的研究方法

早期研究G-四链体与配体相互作用的方法主要是生物化学法，如硫酸二甲酯印迹技术、凝胶迁移实验和DNA聚合酶终止实验等．随着分析仪器的发展，近年来，用于G-四链体结构及其与配体相互作用研究的有各种光谱法，如圆二色光谱、荧光光谱、荧光共振能量转移、核磁共振、X-射线晶体衍射，此外还有表面等离子体共振、电喷雾质谱和毛细管电泳等方法． 3.1　生物化学法(biochemical methods)

硫酸二甲酯印迹(DMS footprinting)、凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)和DNA聚合酶终止实验(DNA polymerase stop assay)等方法均可用于表征G-四链体结构的形成[23, 58, 59]．硫酸二甲酯印迹技术通常与凝胶迁移实验联用．将5′端带有放射性标记的寡核苷酸片段经加热变性和冷却处理形成G-四链体，再使用DMS进行甲基化处理，通过非变性PAGE分离DMS处理的核酸片段，回收后用六氢吡啶切割处理； 再使用变性PAGE分离切割后的片段，并进行放射自显影．因六氢吡啶可对甲基化的鸟嘌呤进行特异性切割，而参与Hoogsteen氢键配对的鸟嘌呤碱基则被保护不能被DMS甲基化，故依据放射自显影结果可推断G-四链体形成的位置．

基于DNA聚合酶终止实验，确定富含鸟嘌呤的核酸序列形成分子内的G-四链体的原理是：DNA复制过程中，DNA聚合酶首先识别模板链，并从5′→3′合成互补链，但DNA聚合酶不能识别模板链中的G-四链体结构，当DNA聚合酶沿着模板链向模板链的5′端延伸的过程中遇到G-四链体结构时，聚合酶与模板脱离，互补链的合成 过程就会停止[60]．Han等[60]发现2,6-二氨基蒽醌 (2,6-diamidoanthraquinone，BSU-1051)能加速终止Taq DNA聚合酶催化的DNA合成．他们设计的核酸模板序列中含有一段富G序列，如果复制过程中富G序列形成了G-四链体结构，则DNA聚合酶在该处位置终止合成，DNA复制的体系中就可能包括引物、全长和半长三种产物．依据放射性自显影的强度还可判断产物所占的比例．研究结果还表明，K+存在时，BSU-1051浓度升高，半长产物的比例增加而全长产物的比例降低．因此可以说 明BSU-1051能够稳定模板链上d(TTGGGG)n 和　d(TTAGGG)n序列形成的分子内G-四链体结构，由此促使聚合酶与模板脱离，复制终止．Palumbo等[61]利用DNA聚合酶终止实验、圆二色光谱以及硫酸二甲酯印迹方法，研究了人端粒(hTERT)核心启动子区域9条可能形成G-四链体的序列，研究表明，端粒酶活性受到抑制的原因不仅是由于G-四链体的配体能识别端粒区域的G-四链体结构，也包括配体对hTERT启动子区域G-四链体的稳定作用． 3.2　光谱法(spectroscopic methods) 3.2.1　圆二色谱法(CD)

具有光学活性的生色基团对平面圆偏振光中的左、右旋两种偏振光的吸收不相同，造成偏振光矢量的振幅差，使圆偏振光变成了椭圆偏振光，表现出圆二色性．圆二色谱是研究核酸结构多态性的重要方法，其光谱图以两种偏振光的吸收差值为纵坐标，波长为横坐标[62]．G-四链体根据核酸链的极性(即核酸链5′→3′极性)，可分为：平行型、反平行型和混合型G-四链体[1]．不同的G-四链体结构具有不同的CD特征谱图，平行型的G-四链体在约265 nm有最大正吸收，同时在约240 nm有最大负吸收；反平行型G-四链体在约290 nm有最大正吸收，而在约265 nm有最大负吸收；混合式的G-四链体构型则包括了290 nm附近的正吸收以及特征的265 nm附近的肩峰[63]．平行型与反平行型G-四链体CD谱的差异源于两种G-四链体结构中鸟嘌呤残基堆积作用的不同[64]．如在pH 7.4 的　100 mmol/L KCl和10 mmol/L Tris-HCl缓冲液中，d(TG3TG3TG3TG3T)为平行型G-四链体结构，而　d(TG3T4G3T4G3T4G3T)为反平行型G-四链体[65, 66]．

CD还用于研究碱基序列、阳离子、化学修饰、配体结合等因素对四链体结构的影响．Paramasivan等[67]的研究表明，在100 mmol/L K+溶液中，CD能反映序列d(TAGGGUTAGGGT)和序列d(TAGGGTTAGGGT)二者间因单个碱基不同而引起的结构变化．Vorlickova等[68]发现人凝血酶核酸适配体5′ GGTTGGTGTGGTTGG 3′(15-TBA)形成的四链体结构在K+溶液中比Na+溶液中稳定．通过实时滴定操作，CD还可表征G-四链体结构随溶液组分变化的改变，如改变阳离子种类、浓度或加入有机溶剂等所引起的构型变化[63]．CD是研究G-四链体的常用方法，其优势是直观、快速、对四链体序列长度不限． 3.2.2　荧光光谱 (FS)

核酸分子自身没有荧光，通常用荧光分子取代核酸序列中某个位置的碱基而使其产生荧光．常用的2-氨基嘌呤(Ap)是腺嘌呤的结构类似物，可取代核酸序列中的腺嘌呤并能与胸腺嘧啶配对，是核酸研究中广泛使用的荧光分子[69]．此外，一些自身具有强荧光的平面芳香化合物可插入G-四链体的G平面间，使G-四链结构产生荧光[70]，据此可判断G-四链体的结构．Nagesh等[71]用Ap取代blc-2启动子区域DNA序列中的腺嘌呤或鸟嘌呤碱基研究了配体TMPyP4与G-四链体的结合，发现TMPyP4与G-四链体采取弱结合方式．此外，Owen等[72]用Ap取代c-myc启动子区域Pu22序列d(TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA)中的A12，通过加入N-甲氧甲基-眉藻素B (N-methoxymethyl-calothrixin B)和眉藻素A(calothrixin A)后荧光光谱的变化，首次获得眉藻素与Pu22序列形成的G-四链体结构存在相互作用的证据．两种眉藻素自身的紫外可见光吸收很弱且不具有荧光，Pu22序列加入眉藻素后荧光光谱发生变化，据此可推断两者发生相互作用．竞争实验还发现眉藻素A与Pu22结合的解离常数在微摩尔级，而N-甲氧甲基-眉藻素B与Pu22的亲和力则低一个数量级．此外，利用荧光光谱还可求算G-四链体与配体结合形成复合物的化学计量数以及平衡常数[73, 74, 75, 76]． 3.2.3　荧光共振能量转移(FRET) 荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energy transfer，FRET)是另一种荧光检测方法．当两个荧光分子足够靠近时，一个荧光分子(供体，donor)吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用将能量向邻近的另一个荧光分子(受体，acceptor)转移，进而使供体分子荧光强度降低，而受体分子发射出强于自身的特征荧光[77, 78]．受激发的荧光供体通过分子间相互作用将能量转移给受体，其能量转移的效率与荧光供体与受体之间的距离成反比，故FRET 的强弱程度与供、受体分子的空间距离密切相关．当二者空间距离为7～10 nm时，供受体分子即可发生FRET，但随着二者间距增加，FRET显著减弱．利用FRET研究配体与G-四链体的相互作用，需在单链DNA序列的5′和3′端分别标记荧光供体和荧光受体分子，这样当单链DNA折叠形成G-四链体结构时，两种荧光基团靠近则产生更强的荧光[79, 80]．Cian等[81]使用FRET检测了人端粒末端G-四链体结构与neomycin-capped acridines 和meridine两种配体结合的稳定性和选择性．配体对G-四链体的稳定效果与所使用的荧光标记分子、缓冲液类型有关，也与计算熔解温度Tm的方法有关．竞争实验显示neomycin- capped acridines对平行型和混合型G-四链体的选择性优于反平行型G-四链体．Gray等[82]利用CD和FERT揭示了K+诱导的人端粒末端序列的单分子G-四链体折叠与展开过程中的细节，由单链折叠成四链体结构要经历三种过渡态．FRET方法克服了分子吸收光谱法和CD的缺点，如所需DNA和配体浓度较高，DNA和配体的吸收区域发生重叠等，但因不同实验室使用的荧光标记分子、缓冲液以及测定熔解温度Tm值的方法不同，FRET方法增加了不同实验室的数据比对的困难．

常规的FRET使用荧光供体和受体进行标记，检测的是荧光分子的平均响应．而单分子FRET(smFRET)则可实时表征单分子内的折叠动力学，直接分析单分子内形成的G-四链体结构的核酸序列[83, 84, 85]．Jena等[86, 87]利用smFRET研究了人端粒末端DNA序列形成的不同结构G-四链体的折叠动力学以及配体稳定下G-四链体结构的动态转变．两端分别用荧光供体Tetramethylrhodamine(TMR)和荧光受体青色素衍生物(Cy5)标记的人端粒末端DNA序列d((GGGTTA)3GGG)(h-telo)，通过生物素-亲和素反应固定在石英表面，h-telo序列折叠形成G-四链体的过程中，两端的荧光供体和受体的空间位置相互靠近，进而发射荧光(图 2b )．在2 mmol/L K+溶液中除部分未发生折叠的单链(U)外，h-telo序列折叠形成两种类型的G-四链体结构F1和F2，U、F1和F2三者的FRET转移效率分别为0.43、0.63和0.80．在饱和的100 mmol/L K+溶液中h-telo序列仅折叠成F2结构，使用不含K+的缓冲液冲洗1 min除去游离的K+后，h-telo几乎全部转变为未折叠单链状态；而在饱和的1 μmol/L 配体macrocycle 1(图 2a)中孵育的h-telo序列仅折叠成F1结构，使用不含K+的缓冲液冲洗，h-telo序列在4h后依然稳定在折叠的G-四链体结构，接着使用100 mmol/L K+溶液继续冲洗去除游离配体macrocycle 1，h-telo序列依然保持F1结构．以上结果说明配体macrocycle 1稳定下的G-四链体结构与近似生理K+环境中的G-四链体结构不同，且配体macrocycle 1较K+对G-四链体的稳定作用更强．

在Watson-Crick碱基配对中氨基质子的化学位移在13～14，而通过Hoogsteen氢键配对形成的G平面具有特征性亚氨质子，其化学位移在10.5～12，因此可利用核磁共振氢谱1H-NMR通过可交换质子的共振信号分析G-四链体结构[88]．1H-NMR检测样品的最低浓度为1～3 mmol/L，且对样品纯度要求较高，为了能够观察全部交换质子，实验通常在低温条件下进行．二维NOE增强谱(nuclear overhauser enhancement spectroscopy，NOESY)可分辨的原子间距小于5Å，是研究G-四链体结构、折叠动力学、稳定性以及分子间相互作用的有效方　法[88, 89]．通过液态NMR研究G-四链体的拓扑学问题时，核酸序列在溶液中应处于动力学稳定结构，如果多种混合结构同时存在，则难以进行正确的结构分析[90]． 早在1993年，Wang等[91]通过1H-NMR、距离几何学以及分子动力学的研究发现，22碱基的核酸序列 d(AG3(T2AG3)3)在Na+溶液中优先形成带有两个侧向loop和一个对角loop的反平行型G-四链体结构．也有研究表明，在K+溶液中，与d(AG3(T2AG3)3)类似的序列采取一种平行　和反平行混合的结构，而在分子拥挤的环境中平　行结构优先[92]．Kato等[93]使用1H-NMR研究了d(TTAGn) 和d(TTAGnT)(n=3～5)随机序列，揭示了G-四链体二聚体的形成，当序列末端添加一个T修饰则可以阻止二聚体的形成．液体NMR也可用于研究G-四链体与碱金属离子的结合及G-四链体结构转变的动力学[94]．Wong等[95]利用23Na-、39K-、87Rb-NMR直接检测出碱土金属离子在溶液状态下与G-四链体结合，Ida等[96]利用 1H-、23Na-和87Rb-NMR研究了碱金属与d(TG4T)、d(G4T3G4)和d(G4T4G4)三种DNA低聚片段的相互作用，发现在由两条d(G4T4G4)序列形成的双分子G-四链体中，Na+ 位于G平面与对角T4 loop之间，同时与四个鸟嘌呤的6位O和对角T4 loop上一个胸腺嘧啶的2位O. Riva等[97]利用NMR研究了G-四链体-萘醌衍生物的复合物，发现配体与四链体外部的G平面结合，并不改变四链体的核心．

近年来发展的固态NMR方法尽管分辨率较液态NMR低，但可用于不溶或者溶解后结构易变的样品[98, 99]．利用固态NMR，如固态23Na-、17O-NMR也可以直接检测G-四链体结构中的碱土金属离子[100, 101]．Rovnyak等[102]利用固态23Na- NMR证实d(TG4T)4序列形成的G-四链体内部有3个Na+． 3.2.5　X-射线晶体衍射(X-ray)

G-四链体结构为靶标的配体和药物分子的研究需要了解四链体精确的拓扑学结构，包括loop结构的信息[90]．X-射线晶体衍射法可达原子级分辨率，是G-四链体研究的重要方法之一．X-ray能提供G-四链体精确的骨架结构和loop构象，还能表征金属离子和小分子配体与G-四链体的结合位置以及与其沟槽的水合作用情况等[103]．但X-ray方法要求高纯度的G-四链体结晶样品．

Kang等[104]在1992年获得尖毛虫(Oxytricha)端粒末端序列d(G3T4G4)分辨率达2.5Å的三维晶体 结构，发现两个d(G4T4G4)序列形成一个双分子的G-四链体．Haider等[105]发现，在K+溶液中序列 d(G4T4G4)形成含有一个对角loop的反平行型双分子四链体结构，该结果与NMR测定的结果相吻合．随后Haider等[106]又获得了d(G4T4G4) G-四链体与取代吖啶所形成的复合物的三维结构，分辨率达到1.75Å，结果显示吖啶部分结合在T4-loop内和G平面之间．Parkinson等[107]的研究表明，人端粒末端重复序列d(TAG3T2A3GT)和d(A3(T2A3)3)在近似体内环境的K+溶液中均形成分子内平行型的四链体晶体结构，且所有的鸟嘌呤都采取反式的糖苷键构象．Doghaei等[108]则利用X-ray和分子动力学模拟研究了分子拥挤效应对G-四链体构型和稳定性的影响，发现在阳离子不存在的条件下，乙醇可 增强G平面内氢键的稳定性进而稳定G-四链体的结构． 3.3　表面等离子体共振(SPR)

基于表面等离子体共振(SPR)设计的生物传感器可实时跟踪生物分子间的相互作用．该方法不需对生物分子进行标记，且无损伤．SPR通过金属介质传感界面上的配体结合生物分子，利用介质表面质量的增加所导致的折射率变化表征分子在传感界面的结合．金属介质表面对光的折射率与结合分子的质量成正比[109]．

SPR能用于表征G-四链体与金属表面上的配体的相互作用，并提供大量相互作用的信息，如相互作用形成复合物的化学计量关系，结合动力学及结合力强弱．Dash等[110, 111]研究了k-ras、c-myc、c-kit1、c-kit2等原癌基因启动子区域能够形成G-四链体结构的序列与配体10(二乙炔基吡啶酰胺，diethynyl-pyridine amides)的结合．SPR测量得到一系列配体与各启动子区域G-四链体结合的平衡解离常数，其中配体10与c-myc G-四链体结合的平衡解离常数Kd=570 nmol/L，与之前报道的G-四链体高亲和力配体Se2SAP(Kd=620 nmol/L)相近[112]，配体10与c-kit2 G-四链体以1∶1的计量关系结合，其Kd=690 nmol/L．SPR结果还发现，衡量稳定性的ΔTm与Kd之间无直接的关联．Murat等[113]利用SPR比较了分子间与分子内G-四链体与TMPyP4、MMQ1、偏端霉素A、DODC等配体结合的亲和力，SPR实验计算得出TMPyP4与分 子间和分子内G-四链体的解离常数分别为9.4×10-8 mol/L和9.1×10-7 mol/L，即分子间的G-四链体与TMPyP4结合的选择性高于分子内G-四链体8倍．但是分子内G-四链体结合的TMPyP4数量却比分子间G-四链体结合得要多，衡量结合量的饱和参数Rm值两者分别为115和80．经过Scatchard分析，证明配体与分子间的G-四链体结合遵循1∶1线性模型的化学计量比，而与分子内G-四链体结合则表现出非线性行为，这与平行/反平行型混合结构G-四链体的存在有关．Romera等[114]计算并比较了金属卟啉衍生物分别与序列d(TTAGGGT)4形成的分子间G-四链体、序列d(GGG(TTAGGG)3 TT)形成的分子内G-四链体以及序列d(CGCGCG- CGT4CGCGCGCG)形成的双链发卡结构相互作用的结合常数，结果显示锰-卟啉衍生物配体Mn-1与分子间和分子内G-四链体的结合常数分别为1.7×107 mol/L和1.8×107 mol/L，但与双链的结合力极弱以致SPR方法不能测定，而配体TMPyP4与双链DNA的结合常数为2.9×106 mol/L，因此Mn-1对G-四链体的选择性更强．T-抗原蛋白对病毒基因组复制以及宿主细胞周期循环起着重要的作用，它可以扮演解旋酶的角色，可解开多种类型的DNA结构．Brennan等[115]报道了SV40病毒编码的T-抗原蛋白对G-四链体结构的解旋酶活性．实时SRP证明，T-抗原蛋白在ATP存在下，可形成一个解旋酶亚基活性中心，该活性中心与单链、双链以及G-四链体DNA结合并联合双链结合蛋白(SSB)即能够解开分子间的四链体结构． 3.4　电喷雾质谱法(ESI-MS)

质谱法是近年发展很快的结构鉴定方法，也是研究核酸与配体相互作用的重要方法之一[116, 117]．电喷雾质谱采用软电离技术，样品在电离过程中产生多电荷负离子，且碎片离子少，适合相对分子 质量大的生物大分子． ESI-MS可用来研究G-四链体结构形成、与配体非共价结合的化学计量关系、四链螺旋DNA与双链DNA之间、分子内与分子间的G-四链体之间结构相互转变的平衡关系等[118, 119, 120]．Vairamani等[121]发现，人凝血酶核酸适配体15-TBA在含K+的体系中，高价态的(M+K)6-和 (M+K)7-的离子丰度很高，而对照序列d(A2T2A2TGTA2T2A2)、d(AGT2AGTGTAGT2AG)、 d(GAT2AGTGTGAT2AG)出现的高丰度离子却是低价态离子(M+K)3-和(M+K)4-，在Na+、Sr2+、Ca2+等体系中也出现类似结果．15-TBA经ESI电离产生(M-nH)n- (n=3～8)离子，离子的电荷与电离过程中丢失的质子数目有关．G-四链体结构中，鸟嘌呤碱基上的氢与羰基氧配对，ESI电离过程中质子丢失的概率小，因此与不能形成四链体结构的对照序列相比，15-TBA产生的高价态负离子的相对丰度较高．以上研究说明，15-TBA与K+、Na+、Sr2+、Ca2+等离子的结合具有专一性，在这几种离子体系中形成了G-四链体结构．Sravani等[122]研究了脱氧鸟苷在5种碱土金属离子存在下G-四链体结构的形成，金属离子对四链体结构的稳定性顺序为：Sr2+>Ba2+>Pb2+>Ca2+>>Mg2+．Li等[123, 124]先后研究了Bcl-2原癌基因和血管内皮生长因子基因(VEGF) 启动子区域G-四链体结构的形成，以及几种小分子与两个区域G-四链体结构识别的特异性．Bcl-2原癌基因的d(G3CGCG3AG2A2G5CG3)序列(S1)在10 mmol/L NH4OAc中ESI-MS谱图的基峰为m/z 1472.8，随着NH4OAc浓度的增加，基峰转变为m/z 2111.8，这说明S1序列形成了双分子的G-四链体结构，结果与凝胶电泳和CD一致．ESI-MS谱图显示VEGF启动子区域d(G4CG3CCG5CG4)序列(S)在甲醇/水溶液(25∶75，v/v)中，产生带有高电荷的去质子化单链离子；而在50 mmol/L醋酸铵溶液中基峰则转变为m/z 1278.1，为带有2个NH4+的离子(S+2NH4+-7H+)5-，此时无规则卷曲的单链状态的离子相对丰度低于8%，这证实了序列S形成了含有3个G平面的G-四链体结构．Collie等[125]和Smargiasso等[126]还揭示了G-四链体多聚体的存在，证明形成高聚合度多聚物的趋势随着loop长度的减小而增加，且短的loop主要倾向于形成二聚体和三聚体．

ESI-MS还用于研究G-四链体的折叠动力学、稳定性以及与小分子的特异性结合等．Mazzitelli等[127]使用ESI-MS和分子动力学模拟的方法研究了气相状态下7种G-四链体结构的稳定性，Rosu 等[128]研究了醋酸铵溶液中寡核苷酸序列dTG5T 形成四分子的G-四链体结构的机制．国内Zhou等[129]使用ESI-MS研究了Tel01、ImImImβDp、PyPyPyγImImImβDp 3种小分子(图 3)与序列(AGGGTT)4 G-四链体结合的亲和力以及相互结合的化学计量关系，其中二萘嵌苯衍生物Tel01倾向于以G-四链体∶配体摩尔比=1∶2 的关系与四链体结合，结合亲和力的大小依次是：Tel01> ImImImβDp>>PyPyPyγImImImβDp．除此，Zhou等[130, 131]还利用ESI-MS研究了环聚酰胺与c-myb启动子区域G-四链体及非平面环形分子小檗胺与(GGA)8 G-四链体的结合．

ESI-MS还可筛选对G-四链体结构具有高亲和性和专一性的天然小分子[131, 132, 133, 134, 135, 136, 137]，Cui等[138]使用ESI-MS研究了启动子区域致癌基因 c-myb上的片段 d(GGAGGAGGAGGA)形成的G-四链体结构，并发现从中药延胡索(corydalis yanhusuo)块茎中提取的小分子脱氢紫堇碱(dehydrocorydaline)对该四链体结构具有极强的亲和力，其与G-四链体结合的选择性甚至强于TMPyP4．此外，Ferreira等[139]结合ESI-MS和离子迁移谱法研究了溶剂效应对端粒末端d(TAG3TTAG3T)序列G-四链体形成和结构转变的影响． Mironov等[140]使用ESI-MS和动力学毛细管电泳研究了溶液中DNA G-四链体结构形成的构象动力学．Marchand等[141]发现三甲基胺醋酸盐(TMAA)缓冲液中，在近似生理环境K+浓度下的G-四链体结构有清晰的ESI-MS图谱，很容易确定在G-四链体结构上特异性结合的K+数目． 3.5　毛细管电泳法(CE)

毛细管电泳是高效、快速的微量分离分析技术，具有分析模式多样、样品用量少、研究成本低等明显优势，也是研究靶分子与配体相互作用的有效方法之一[142, 143]．亲和毛细管电泳(ACE)中通过受体与配体发生亲和作用前后电泳图谱的明显变化，可测定亲和常数，获得结构变化等信息．Huang 等[144]利用ACE研究15-TBA与蛋白质的相互作用，证实适配体形成G-四链体结构才能与凝血酶结合形成复合物．在CE方法中，G-四链体与配体的相互作用在溶液相进行，G-四链体、配体以及二者形成的复合物三者可完全分离，并可在线定量检测．Szilagyi等[145]利用毛细管凝胶电泳(CGE)研究了富G序列G-四链体结构的形成以及单价阳离子浓度对四链体结构的影响．电泳图显示15-TBA的 5′ GGTTGGTGTGGTTGG 3′序列在高浓度K+体 系中能够出现独立的G-四链体峰，而随机序列5′ GGTGGTGGTTGTGGT 3′则不能．Xu等[146]首次使用非平衡毛细管电泳(NECE)研究了G-四链体与双链DNA竞争的双平衡系统，该方法在非平衡 状态下能够有效地对人端粒末端DNA及互补序 列的混合物进行分离．如图 4，由寡核苷酸序列 5′ TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 3′(ssDNAG)和5′ CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA 3′(ssDNAC)以摩尔浓度1∶1的比例孵育形成的平衡混合物包含游离ssDNAG、游离ssDNAC、双链DNA和G-quadruplex四种组分，ssDNAG的5′端标记荧光分子6-Carboxyfluorescein(6-FAM)，但ssDNAC没有标记，因此ssDNAC在荧光检测图中不出现，而游离ssDNAG、双链DNA和G-quadruplex三种成分均可在NECE电泳图中形成独立的峰．从NECE电泳图获得的数据如迁移时间、峰面积等可计算出G-四链体折叠与展开的速率常数、双链DNA结合与解离的平衡常数．五组实验测得的动力学常数的RSD小于0.5%，说明所用NECE方法的稳定性和重现性好．Mironov等[140]利用动力学毛细管电泳电喷雾质谱联用(KCE-MS)研究了溶液中DNA G-四链体的结构动力学，并提出CE中峰的迁移和拓宽可用来确定DNA-金属亲和作用和DNA折叠的速率常数和平衡常数．

生化法可从基因的任意起点研究G-四链体结构，该方法接近生物体内的真实环境，有利于揭示G-四链体在生物体内的作用机理．但操作过程复杂耗时、自动化程度低．圆二色谱法可实时检测，提供G-四链体结构中四条核酸链相对极性的信息，进而判断G-四链体的结构类型，但不能提供各原子的信息和精确的三维结构，也无法确定配体结合的模式．故CD常与NMR和X-ray结合应用．荧光光谱法灵敏度高、线性浓度范围广，该方法需要使用荧光配体或是具有荧光的碱基类似物，可用于表征G-四链体结构的形成并求算G-四链体与配体结合形成复合物的化学计量数以及平衡常数．荧光共振能量转移可用于研究配体与四链体结合的选择性和稳定性，FRET方法克服了分子吸收光谱法和CD的缺点，如DNA和配体的吸收区域发生重叠等．但如果使用的荧光标记分子、缓冲液以及测定熔解温度Tm值的方法不同，会增加数据比对的困难．因整体反应的同步化存在困难，故FRET不能用于动力学的研究，但smFRET则可用于研究单个分子的折叠动力学，且稳定性更高．核磁共振与X-射线衍射的分辨率高，都能够获得G-四链体和配体复合物中原子级别的精确结构信息．前者可用于研究G-四链体折叠动力学以及其与配体结合的模式和化学计量关系．后者能提供G-四链体精确的骨架结构和loop构象，但两种方法对样品的纯度要求很高．等离子表面共振需要对样品进行生物素标记，优势是能同时研究多个样品，提供G-四链体与金属表面上的配体相互作用的定量信息，如化学计量关系、结合动力学和结合力强弱．电喷雾质谱法也可研究结构的稳定性并获得配体结合的化学计量关系，提高样品电离效果通常需采取高电压并加入有机溶剂或铵盐等，因此需要考虑其他因素对结构的影响．毛细管电泳是高效的微量电泳分析技术，样品用量极少，可用于研究G-四链体的形成及与配体的相互作用，利用非平衡毛细管电泳可计算G-四链体折叠与展开的速率常数．综上所述，G-四链体与配体相互作用的研究方法各具特点和优势．同时，各种方法也存在一定局限性．各种方法的比较见表 1．

G-四链体是非经典的核酸二级结构，其表现出广泛的多态性且在生物学过程中具有特定的功能．研究G-四链体结构的多态性及其与各种配体的相互作用机制，是研究基因代谢和疾病治疗的基础．基于G-四链体的组成和构象差异及其与配体作用后导致的分子结构与形态以及旋光性、质子化学位移、基团间距等性质变化，为G-四链体结构多态性及与配体作用机制提供了大量信息．尽管上述多种方法均用于研究G-四链体与配体相互作用，但这些方法都是局限于体外实验，目前直接用于体内研究的方法很少．最近，Biffi等[36, 147]和Henderson等[148]利用能够高度专一识别G-四链体的抗体先后对人类癌细胞中的DNA G-四链体和RNA G-四链体进行了可视化研究，获得了G-四链体在人体细胞内存在的直接证据，也为体内G-四链体的存在以及与配体作用的深入研究提供了新的思路和方法．相信分析技术的进步和研究方法的完善，将为以G-四链体为靶点的新药设计和研发以及癌症等疾病的治疗提供重要的技术支持．近期，基于G-四链体DNA与配体相互作用的传感器设计和无需标记的样品检测方法受到广泛关注，基于G-四链体与配体相互作用的金属离子[149, 150]、PCR扩增产物[151]、血红蛋白[152]、凝血酶[153]、抗生素[154]和转基因食品[155]的检测方法以及逻辑门路设计[156]相继出现，此类检测方法检出限较低、灵敏度相对较高、线性浓度范围较广且很多检测装置便携、快速、易操作．笔者认为这将成为分析化学和应用化学领域又一个研究热点．