为什么要测ROS？

ROS（Reactive Oxygen Species）：活性氧

ROS的主要来源是细胞的线粒体呼吸链，线粒体受外界刺激后，细胞ROS水平会升高。过量ROS反过来会对线粒体造成损伤，可能引发线粒体自噬。

市面上常见的两种荧光探针ROS检测试剂盒：

探针检测ROS的原理——可自行搜索试剂盒说明书，并下载阅读（bing搜ROS assay kit）。

如果我的细胞系会表达GFP绿色荧光蛋白，应该选用哪种探针检测ROS？为什么呢？

实验操作流程：（贴壁细胞为例）

消化细胞并计数，种在24孔板中，确保每孔中细胞数量相等，3个复孔。

细胞密度约80%时，实验组加药培养6h，对照组DMSO处理。

配置探针孵育工作液：避光操作，用培养基稀释探针（1:1000），终浓度10μM(或5μM)。

吸掉旧培养基，PBS洗细胞一次。

避光操作，每孔加入500μl探针工作液，37℃培养箱孵育10-20min（时间过长会导致背景信号高）。

弃掉探针孵育工作液，PBS温和地洗2-3次，然后各孔加入400μl培养基。

利用荧光显微镜200倍观察细胞内红色荧光，调整分辨率、亮度、锐度等到合适的参数，最后每孔随机拍照3张，保存图片。分析结果。

消化细胞并计数，每孔种10000个细胞，每个处理3-5个复孔。

细胞密度约80%时，实验组加药培养6h，对照组DMSO处理。

配置探针孵育工作液：避光操作，用培养基稀释探针，终浓度10μM。

吸掉旧培养基，PBS洗细胞一次。

避光操作，每孔加入100μl探针工作液，37℃培养箱孵育20min。

弃掉探针孵育工作液，PBS温和地洗1次，然后各孔加入100μl培养基。

在荧光酶标仪上检测荧光强度，保存数据。

之后需要检测CCK-8的操作步骤（检测细胞数量）

配置CCK-8检测工作液，每孔100μl工作液，额外加3个空白孔blank，孵育1h后去检测OD450的值。

荧光强度与总细胞数的比值就是相对ROS水平。

计算方法：ROS的检测值/对应孔CCK-8的检测值。

分析各组ROS水平的差异。

实验要点：

细胞初始数量要相等，ROS工作液需要避光，先用PBS洗干净探针再去检测荧光强度。

具体的探针浓度以及孵育时间，需要自行摸索。

（浓度太高或者时间太长，会导致背景信号高）