王剑，医学博士，研究员，博士生导师，现为上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心遗传分子诊断科主任、上海市儿童罕见病临床医学研究中心执行副主任、上海市儿科临床分子诊断重点实验室副主任。获得上海市青年优秀学术带头人、上海市十佳医技工作者、曙光人才等荣誉称号。担任中华医学会检验医学分会青年委员、中华医学会儿科分会罕见病学组委员、上海市医学会检验青委副主委等学术职务。以课题负责人承担国家级、市局级课题20多项，发表研究论文200余篇（包括SCI文章100多篇，总影响因子>300），代表性论文以第一作者或通讯作者发表于《新英格兰医学杂志》、《Genetics in Medicine》等国际医学期刊。

【摘要】遗传性疾病指遗传物质改变导致的疾病，具有病种多、临床表现复杂，治疗方法相对有限等特点，遗传性疾病的预防、诊断和治疗对于提高人口素质至关重要。分子诊断技术的发展、推广和规范化管理大力推动了遗传性疾病的诊断、机制研究和治疗探索。本文基于分子诊断技术在遗传性疾病中的应用现状，重点介绍分子诊断新技术的发展趋势和应用价值，以期加深临床对分子诊断技术的认识，从而合理应用于遗传性疾病的诊断。

【关键词】遗传性疾病；分子诊断；数字PCR；高通量测序；核酸质谱

遗传性疾病是指由生殖细胞遗传物质的改变而引发的疾病，包括染色体病、基因组病、单基因病、线粒体基因病和多基因病等。由于遗传性疾病病种繁多，临床表现复杂多样，且多为罕见病，临床上极易发生漏诊、误诊。目前除了少数遗传病通过干预可获得良好的预后，绝大多数遗传病仍缺乏有效治疗手段[1, 2]，因此遗传病的预防、诊断和治疗是一大亟待解决的医学问题。分子诊断技术指应用分子生物学方法，检测患者来源遗传物质的结构或表达水平，以帮助临床精确诊断、制定个体化治疗方案和评估疗效及预后。根据方法原理可大致分类为聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、分子杂交、测序技术、核酸质谱和生物芯片等[3, 4]。分子诊断技术的应用和发展极大地改变了疾病的诊疗模式，使遗传病的诊断与防治困境得以改善。自1976年液相分子杂交技术首次用于α-地中海贫血的产前基因诊断，1985年PCR技术的发明，以及近年来第二代测序技术的普及，遗传病的分子诊断不断获得突破性进展。本文基于分子诊断技术在遗传病诊治的应用现状，重点介绍分子诊断新技术的发展趋势和应用前景，分析各技术应用于不同类型遗传病诊断的优缺点，以期帮助临床更好地认识分子诊断技术，从而合理应用于遗传性疾病的诊断。

一、经典分子诊断技术

1. PCR：PCR技术的发明和应用是分子诊断技术发展史上的里程碑性事件，引领体外诊断迈入“分子时代”。PCR技术，即在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下进行的依赖DNA聚合酶的酶促合成反应，可特异性指数级扩增DNA分子以进行检测。基于PCR技术，衍生开发了一系列相关检测方法，如实时荧光定量PCR技术，可应用于拷贝数变异检测和基因位点分型等，但因通量低限制了其在遗传病诊断中的广泛应用；高分辨率熔解曲线技术可用于遗传病基因突变筛查；PCR结合Southern印迹可用于检测脆性X综合征等由三核苷酸重复序列突变所致遗传病[5]。另外，限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）作为第一代分子生物学标记，可通过检测DNA经限制性内切酶酶切形成的特定DNA条带组合，反映可引起新增或丢失酶切位点的突变，但RFLP过于依赖限制性内切酶的种类，其承载的多态性信息十分有限，且步骤繁琐、成本较高，限制了其在遗传病临床诊断中的应用[6]。

2. 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）：FISH指荧光标记探针通过碱基互补配对原则结合靶DNA，以分析染色体数目与结构变异，是一种非放射性原位杂交技术[7]。FISH多用于染色体病的筛查，是胚胎植入前遗传学诊断和妊娠期产前诊断的重要技术。近年来，FISH不断发展，从单色荧光到多色荧光，灵敏度和分辨率也大幅提高，但其检测位点仍受限于探针序列的特异性。

3. 染色体微阵列分析（chromosomal microarray analyaia，CMA）：CMA又称为“分子核型分析”，通过将覆盖染色体重要片段的DNA探针固定在固相支持物上，将标记的待测样本分子杂交，检测杂交信号以分析全基因组拷贝数变异、单亲二倍体、杂合性缺失以及嵌合体等异常。CMA技术无需细胞培养，可检测＞1kb的微缺失/微重复，检测周期较短，检测平台可定制，现已广泛应用于胚胎植入前遗传学诊断、产前诊断、新生儿筛查及遗传病诊断等领域，主要针对发育迟缓、智力障碍、多发畸形、孤独症、神经肌肉疾病、先天性心脏病和先天性代谢性疾病等[8]。但CMA无法检测染色体平衡易位、倒位等染色体结构性变异，低水平嵌合的检出取决于不同检测条件，无法检测平台未覆盖基因组领域的拷贝数变异。

4. 一代测序（Sanger测序）：20世纪70年代，Sanger测序技术问世，该技术通过双脱氧链终止法从单个碱基水平获得序列信息，单次可检测700-1000 bp的DNA序列，准确性高，测序结果直观可视，至今仍然是基因测序的“金标准”。人类基因组计划进一步促进了以Sanger测序为主的基因诊断。对于临床诊断比较明确，遗传异质性不强的疾病，如MECP2基因突变导致的Rett综合征、OCA2基因突变的导致白化病等，Sanger测序可精确快捷地进行诊断[9, 10]。但Sanger测序灵敏度较低、通量小、成本相对高，不适用于无明确候选基因或候选基因数目较多的情况。

二、分子诊断新技术

1. 数字PCR（digtal PCR，dPCR）：dPCR是一种可对目标DNA模板绝对定量的新一代PCR技术，通过有限稀释待测核酸溶液并分配到不同反应单元，使每个反应单元的核酸模板数少于或等于1个，经过特异性探针扩增，检测各反应单元的荧光信号，依据泊松分布原理及阳性反应单元数目获得靶分子的起始拷贝数。按照分液方式可分为微流体数字PCR、微滴数字PCR和芯片数字PCR。dPCR可富集待测序样本中的靶基因，检测基因组拷贝数变异、甲基化含量、基因表达绝对定量，具有灵敏度高、样本需求量少等优点，在无创产前诊断及遗传病诊断方面有广阔的应用前景[11-13]。但dPCR也存在成本高、操作繁琐、通量有限等不足，相信随着技术优化、自动化程度提高，其技术优势可得到进一步挖掘。

2. 二代测序（next-generation sequencing，NGS）：NGS又称高通量测序，是一种大规模平行测序技术，可同时测定几十万至几百万条DNA分子。根据检测范围不同，NGS可分为全基因组测序、全外显子组测序和靶向基因组测序。靶向基因组测序多针对经评估明确致病的基因，测序深度较高、成本较低；全外显子组测序和全基因组测序则可能发现新的致病基因，后者还可以检测到非编码区变异，通量大、数据丰富。NGS的广泛应用面临着数据分析与质控、基于海量数据的变异解读和遗传咨询规范化等挑战，需要依托专业的遗传学及生物信息学团队。随着测序成本降低、生物信息学的快速发展，遗传病的临床诊断愈来愈得益于对测序结果的精确解读。目前NGS已经成为遗传病基因诊断的主要方法，可检测单个碱基到几个碱基突变，亦可检测基因组拷贝数变异[14, 15]。但NGS读长短（仅约150bp），无法准确检测三核苷酸重复所致疾病如脆性X综合征；无法区分同源性高的假基因；无法准确检测小范围拷贝数变异如微缺失、微重复等[16-18]。

3. 第三代测序：第三代测序技术的特征在于单分子测序，无需PCR扩增即对单个DNA分子进行测序。按原理不同可分为单分子实时测序技术（single-molecule real-time sequencing technology，SMRT）和纳米孔测序技术。SMRT技术在每个零模波导孔中，以待测DNA分子为模板，在DNA聚合酶催化下按照碱基互补配对原则，带有不同荧光标记的dNTP进入孔中参与合成，通过检测荧光信号，以达到边合成边测序的目的[19]。纳米孔测序技术则检测待测DNA链以单个核苷酸的步长通过纳米孔时相应的堵孔信号，以获得DNA序列信息。第三代测序技术具有超长读长，相对于NGS克服了很多不足，SMRT平均读长可达约10kb，纳米孔测序技术则可达5kb；因无需扩增可有效避免扩增引入的系统偏向性；可用于检测高度杂合基因组以及大的结构变异等[20, 21]。第三代测序技术在遗传病诊断中已有应用，Merker等人通过该技术检测到PRKAR1A基因结构变异，从而诊断1例Carney综合征患者[22]。目前第三代测序技术仍存在错误率较高的问题，其中SMRT可达约15%，即便可通过多次重复克服随机性误差，仍限制了其在临床诊断中的应用[23]。随着技术进步，第三代测序技术将向长读长、低错误率发展，以更适用于遗传病的临床诊断。

4. 多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）：MLPA是一种中通量的可同时检测多个DNA序列的定性和相对定量的分子诊断技术。该技术针对基因组靶区域设计多对杂交探针，经复性杂交连接，通过通用引物同时扩增多个基因组靶区域，以扩增信号的强度反映基因组靶区域的拷贝数。该技术可检测基因组中的微缺失和微重复以及DNA甲基化水平，临床上多用于诊断由基因组缺失/重复或由表观遗传异常所导致的遗传性疾病，如脊髓性肌萎缩症、假性肥大型肌营养不良、Prader-Willi/Angelman综合征等，在产前诊断方面也有着很大的应用价值[24]。MLPA技术具有成本较低、灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，但该技术具有无法检测低水平嵌合和染色体平衡易位，不适合检测未知的点突变类型等局限。

5. 微流控芯片：微流控芯片，又称芯片实验室（lab-on-a-chip），指在微纳米尺度空间操控流体进行实验的技术。通过微加工工艺得到流体通道、反应腔室等微结构单元，操控流体配合仪器完成实验室检测各步骤。Yang等人研发了基于流体力学分离和免疫识别的胎儿细胞捕获芯片，可高效富集胎儿细胞，在孕早期实现胎儿细胞的有效分离，并可通过Y染色体基因特异性分析，确认胎儿细胞来源。该技术样本需求量少、检测覆盖率高，利于早期筛查和诊断，可为无创产前诊断提供新的技术支持[25]。日前，用于遗传性耳聋相关基因检测的微流控芯片法试剂盒业已通过国家药品监督管理局批准，该方法联合竞争性等位基因特异性扩增技术，检测常见耳聋基因的23种突变，可帮助临床筛查遗传性耳聋患者[26]。但微流控芯片研发周期长、生产过程较为复杂、对专业技术要求高，尚待降低生产成本以推广其在遗传病诊断中的应用。

6. 单分子光学图谱技术：单分子光学图谱技术可经内切酶原位切割DNA分子并标记荧光，获得限制性内切酶酶切位点分布图，有利于分析高复杂区重复序列和基因组结构变异。结合NGS能够克服其读长短的缺陷，帮助精确组装基因组[27-29]。美国BioNano公司开发的光学图谱平台在临床诊断中的有效性已得到验证，可成功鉴定杜氏肌营养不良症和肩肱肌营养不良症的各种结构变异[30, 31]。该法可检测kb级别的平衡变异，灵敏度高；但无法检测微小片段插入或缺失，且样本处理、检测流程和数据分析尚待进一步优化。

7. RNA测序（RNA-seq）：RNA-seq即采用NGS技术对转录组进行测序，可检测编码区或非编码区变异对基因表达水平及选择性剪接的影响。2017年Cumming等人通过RNA-seq诊断遗传性肌肉疾病，检出率高达35%，并且显示了RNA-seq在剪接位点变异的检测中相较于全基因组测序和全外显子组测序的巨大优势，首次证明了RNA-seq在遗传病诊断中的重要意义[32]。随着NGS和生物信息学分析的进步，双组学或多组学分析更加有利于遗传病的诊断和机制研究。NGS结合RNA-seq既可在DNA层面鉴定到致病基因突变，又可在RNA水平监测到各基因转录水平差异及通路富集情况。Starokadomskyy等人应用全基因组测序结合RNA-seq诊断出导致X连锁网状色素异常的POLA1基因突变，同时也揭示了该基因导致疾病的机理，有利于发病机制和治疗方法的研究[33]。此外，NGS联合RNA-seq还可避免遗漏假外显子相关的深度内含子突变，帮助提高诊断率和致病性证据等级，有望成为适用于遗传病诊断的更加全面的分子诊断策略[34]。但RNA-seq受到基因在不同组织细胞表达特异性的影响，在选择检测材料上易受限制，并且逆转录过程可能出现错误，对大量数据的高效分析也是一项挑战，这些局限性对其在临床上普遍推广带来了困难。

近期张锋等人基于RNA-seq结合CRISPR-Cas9开发出在体Perturb-seq技术，应用于自闭症谱系障碍和神经发育迟缓风险基因的研究。利用该技术在细胞类型复杂多样的神经组织中，可从单细胞水平揭示不同风险基因不同突变位点对各种细胞各阶段状态的影响，该技术在将来可用于多种疾病和组织，对于神经系统相关疾病以及多基因病的诊断和机制研究提供了一种体内大规模系统遗传研究的有效工具[35]。

8. 核酸质谱：核酸质谱技术主要是依托基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）与分子生物学技术相结合进行检测。MALDI-TOF MS可对离子化的待测样品通过脉冲电场加速，经测定不同分子量的离子以各自的恒定速度飞向离子检测器所需飞行时间，并经换算以区分不同分子量的物质[36]。核酸质谱在遗传病领域主要有以下几种应用：①基因突变检测，主要基于PCR和单碱基延伸技术；②DNA甲基化水平检测主要通过将甲基化和未甲基化的C碱基比例转换为分子量相差16Da的G碱基与A碱基之间的比例，来估算片段平均甲基化水平；③拷贝数变异检测，通过单核苷酸多态性等位基因比例来对靶基因进行定量分析；④核酸质谱对NGS结果验证的灵敏度高于Sanger测序，尤其对于比例低于15%的突变，当NGS和Sanger测序结果不一致时可通过核酸质谱进一步验证[37]。核酸质谱通量高、准确度高、灵活性高、检测成本低、周期短，是一种性价比高的中等通量检测技术，在遗传病筛查和出生缺陷防控上有着广阔的应用前景，目前在遗传性耳聋和地中海贫血等疾病的诊断筛查中已得到运用。但质谱技术对样本处理要求高，易受PCR污染影响，在图谱采集和数据分析等方面尚无统一标准，可能影响室内和室间重复性。相信随着技术的进步、规范和推广，核酸质谱凭借自身特色将跻身遗传病分子诊断技术前列。

三、小结与展望

近年来分子诊断技术飞速发展，从技术原理的优化、操作上的自动化到检测通量的提升，逐渐向微型化、集成化和智能化发展。分子诊断技术的推广应用和规范管理有力地推动了遗传病的诊断、机制研究和治疗探索。分子诊断新技术高效助力遗传性疾病的精准诊断，新技术的开发均是基于经典技术的原理，新旧技术各有长短，在临床应用中应当依据实际情况选择最合适的方法。

遗传病的治疗方案相对有限，多为对症治疗，对发病机制了解得越透彻全面，越有利于治疗药物的研发。而分子诊断技术的灵活应用可以在遗传病发病机制和治疗方法研究中发挥重要作用，尤其是多组学研究有助于进一步认识基因突变对机体、组织、细胞的分子水平的影响。并且随着生物信息学的发展，大数据分析技术不断优化和进步，愈来愈多的有效信息将被挖掘和利用。相信随着分子诊断学技术的发展，人们对遗传病的认知将愈加深刻，在诊断和治疗上也将更加全面、深入和成熟。

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