3)吹打混匀，42℃反应2min

4)逆转录：1ul茎环引物（stem-loop）+试剂盒中逆转录MIX（2ul+2ul）+free-RNase H2O（5ul）(to 20 ul)

5)一般来说，一次逆转录只能进行一个miRNA的单独逆转录，但是根据实际情况而言，我们可以将miRNA+内参U6混合在一管中一同逆转成cDNA。

根据以上试剂盒设计的加样量，我尝试过一管内混合逆转录内参+5个miRNA，其中主要的变化就是在第一步增大所加入RNA的量，在第二步加茎环引物时，我们可以将所加入的free-RNase H2O（5ul）替换成不同的茎环引物(5个)，这种方式在特异性的基础上又比较高效的合成多个miRNA，虽然节省试剂，但是也存在弊端，例如我们加入Mix(包含酶或dNTP等)都是一定量的，加入过多的茎环引物合成最终的各种miRNA的cDNA产物可能存在浓度过低，混合不匀可能会影响后续的荧光定量。

③荧光定量（qPCR）

1)荧光定量引物的设计：由于茎环引物存在一段通用序列，因此使用的反向引物（下游引物）一般也是通用的且试剂盒会配备有，此时我们只要设计特异的正向引物（上游引物），在遵循引物设计原则（长度18-26bp；GC含量：40%-60%；Tm:55-60℃）的基础上，正向引物=自身成熟序列去除茎环引物中的6个碱基5’-3’端剩下的碱基:正向引物：TGTAAACATCCTACAC，但是一般我们会对引物进行调整，与下游引物的Tm值相适应，调整荧光定量PCR的引物长度在5’端增加碱基C/G。茎环序列为：

5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′，则通用反向引物为：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′

2)荧光定量：10ul体系（20ul体系减半）(SYBR染料法)：

5ulSYBR+1ulcDNA+2ulfree-RNase H2O+2ul正反引物（提前混合）

例如：RT-qPCR分析hsa-miR-30b-5p的差异表达水平，以U6为内参：

对照组+处理组：此时为了减小误差bar的大小做4个复孔，以八联管为例：

④上机操作：以BIO-RAD为例：

(1)电脑上：点开桌面程序，点击User-defined

(2)设计Protocal，点击Create NEW

(3)定义plate:点击Create NEW

(4)染料法选择SYBR

(5)选择unknow

(6)选择样本孔（well），点击SYBR，定义样本

(7)检查程序，打开仪器盖子，放置八联管，关闭盖子，点击“start run”

2. miRNA加尾法逆转录+通用荧光定量PCR

①逆转录（RT）:

将提取的RNA按照试剂盒的体系配置好，该步骤我们只需提供RNA，其余逆转录引物、逆转录酶以及dNTPs包含在Mix中。一管内即可逆转录多个miRNA的cDNA。

②荧光定量（qPCR）:使用通用荧光定量试剂盒

加尾法的上游引物（正向引物）设计：

例如hsa-miR-30b-5p的成熟序列为UGUAAACAUCCUACACUCAGCU，U全部换成T：TGTAAACATCCTACACTCAGCT即为加尾法的正向引物；

加尾法的qPCR反应体系跟普通的qPCR体系一样，程序也类似。但是如果一次做许多的miRNA，在一次qPCR反应后可以观察熔解曲线看该引物特异性是否较好，也可通过优化下退火温度，改善正向引物。

三、经验分享

（1）茎环法：对于每个miRNA都会设计特异的逆转录引物并进行单个miRNA的单独逆转录；另外，也会设计特异的qPCR特异正向引物。因此推荐是每个miRNA都单独逆转录，特异性比加尾法高，但是一次只能测一种miRNA。然而尝试过一管逆转录5个miRNA+U6，但对于后期qPCR的结果熔解曲线显示特异性良好，但是个别复孔的Cq偏低，可能是cDNA并未混匀的原因。因此，茎环法对于适用于研究1-2两个miRNA，特异性较好。

引物特异性较好，单峰比较尖锐

（2）加尾法：该方法的试剂盒可对所有的miRNA都进行polyA加尾，同时用通用的逆转录引物，把所有的miRNA都逆转录，逆转录的产物就可以分别用于各个miRNA的qPCR的反应，因此，我们只需一次逆转录样品即可。方法比较高效，但是可能造成较差的特异性。加尾法适用于多个miRNA (3个以上)的研究，即大量miRNA前期的筛选，因为一次逆转录可以进行多个miRNA的qPCR扩增，更加方便。

引物特异性较差，出现双峰，可能存在引物二聚体

（3）两种方法结合使用，在试剂有限且要分析大量miRNA的基础上，我们可以筛选出引物特异性不好的miRNA继续使用茎环法，而正向引物特异性较好的仍然使用加尾法，在筛选出固定miRNA进行具体分析时，我们仍可以沿用茎环法。

本文作者是"旺旺仙贝"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。

文稿：旺旺仙贝

校对：煲仔饭

素材：Canva

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