案例背景

使用IPTG诱导表达目的蛋白a。优化表达条件，将诱导条件调整至37℃，经分析目标蛋白主要呈包涵体形式。因此通过变复性的方式，重溶目标蛋白a，通过Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。

蛋白表达鉴定结果分析

IPTG诱导蛋白表达，经12% SDS-PAGE分析，目标蛋白主要存在于沉淀中，结果如图所示

包涵体蛋白的变复性

1. 将菌体沉淀重悬于20 ml 裂解液 （20 mM Tris-HCl containing 1 mM PMSF and bacteria protease inhibitor cocktail, pH 8.0），超声破碎（功率400 W，工作4sec，间歇8sec，共20min）；

2. 将超声破碎的细胞裂解液4℃ 10000 g离心20 min，收集沉淀；

3. 使用包涵体洗涤液（20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0）洗涤包涵体3次；

4. 用溶解缓冲液（20mM Tris，5mM DTT，8M尿素 pH8.0），按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，15000 rpm离心15min；

5. 将上述溶液滴加20 mM Tris-HCl ，100 mM NaCl ，pH8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，pH8.0溶液中透析过夜。

包涵体融合蛋白的Ni柱亲和纯化及结果分析

包涵体蛋白Ni柱纯化

1. 利用低压层析系统，包涵体溶液以0.5 ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱；

2. 用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

3. 用Ni-IDA Washing-Buffer（20 mM Tris-HCl，20 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0） 以1 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

4. 用Ni-IDA Elution-Buffer（20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0） 以1 ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；

5.上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20 mM Tris-HCl，0.15 M NaCl，pH8.0进行透析过夜；

6. 进行12% SDS-PAGE分析, 结果如Fig.2所示。

纯化结果分析

包涵体经过变复性的方式，重溶目标蛋白，通过Ni柱亲和纯化获得目标蛋白，进行12% SDS-PAGE分析。

Western Blot方法检测包涵体复性

（1） 取样品上样5 μl

（2）上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90 V跑完积层胶，再将电压升至200 V直到电泳结束。

（3）电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100 V转膜，约为1.5h，恒流250 mA

（4）电转结束后，取下膜后先用PBST洗涤4次，每次5min。

（5）将膜置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃ 1h。

（6）用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。

（7）次日将膜取出后用PBST 洗膜4次，每次5 min，

（8）用含5%牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1h。

（9）反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5 min。

（10） ECL显影，曝光。

Western Blot结果分析

一抗以及二抗稀释比例：

相关服务

猜您想看：