1.2.1 细胞培养: HGC-27细胞, 用含10% FBS的RPMI 1640培养液置于CO2培养箱中培养HGC-27细胞. 当细胞融合至90%时, 用0.25%胰蛋白酶消化, 传代培养.

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖抑制率: 将200 μL对数期HGC-27细胞(5.0×104个/mL)接种至96孔板中, 培养4 h后, 弃培养液, 分别用含0、5、10、20 μmol/L[4]连翘苷的培养液培养, 分别记为对照组、连翘苷低剂量组、连翘苷中剂量组、连翘苷高剂量组. 培养24 h后, 加10 μL CCK-8, 孵育2 h, 用酶标仪(波长450 nm)测光密度(optical density, OD)值. 增殖抑制率(%) = (OD对照组-OD实验组)/OD对照组×100 %. 实验重复3次.

1.2.3 克隆形成实验: 取2.5 mL对数期HGC-27细胞(5.0×104个/mL)接种至6孔板中, 按上述1.2.2分组处理. 每2 d更换一次, 培养14 d. 弃培养液, 经多聚甲醛固定、结晶紫染色后, 显微镜观察, 统计克隆形成数. 实验重复3次.

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭: 取2.5 mL对数期HGC-27细胞(5.0×104个/mL)接种至6孔板中, 按上述1.2.2分组处理. 培养24 h后, 收集细胞, 并调整各组细胞浓度为2.5×105个/mL. 侵袭实验: 将Transwell小室置于24孔板中, 铺Matrigel基质胶, 自然晾干. 取100 μL各组细胞悬液加至上室, 500 μL完全培养液加至下室. 培养24 h后, 弃培养液, 用多聚甲醛固定、结晶紫染色会后, 显微镜观察, 记数. 迁移实验: 除不铺Matrigel基质胶外, 操作过程与侵袭实验相同.

1.2.5 蛋白质印迹(Western blotting)法检测E-cadherin和N-cadherin蛋白表达: 取2.5 mL对数期HGC-27细胞(5.0×104个/mL)接种至6孔板中, 按上述1.2.2分组处理. 培养24 h后, 用RIPA试剂提取细胞中总蛋白, BCA法检测蛋白浓度. 行10% SDS-PAGE电泳, 将分离蛋白转至PVDF膜, 用5%脱脂奶粉封闭1 h. 于4 ℃冰箱中分别用E-cadherin(1:500)、N-cadherin(1:500)、GAPDH(1:1000)一抗孵育过夜, 洗膜后, 再于山羊抗兔二抗(1:2000)中37 ℃孵育1 h. 加显影液, 避光显影, 曝光拍照.

1.2.6 试剂盒检测细胞培养上清液中TNF-α和IL-6表达: 取2.5 mL对数期HGC-27细胞(5.0×104个/mL)接种至6孔板中, 按上述1.2.2分组处理. 培养24 h后, 收集各组细胞培养上清液. 3500 r/min离心10 min后, 分别利用TNF-α和IL-6试剂盒检测上清液中其表达水平.

1.2.7 qRT-PCR检测LINC00342表达: (1)细胞接种和处理同1.2.5, 培养24 h后, 收集细胞, 检测细胞中LINC00342表达; (2)在液氮保护下, 研磨组织样本, 检测组织样本中LINC00342蛋白表达. 用RNA提取试剂盒提取细胞或组织中总RNA, 逆转录后, 行PCR扩增. 引物序列: LINC00342上游5'-CGTTCCAATGTGTTGGGT-3', 下游5'-TGGGAGGAGGTTGAGATG-3'; GAPDH上游5'-ACGGATTTGGTCGTATTGGGCG-3', 下游5'-CTCCTGGAAGATGGTGATGG-3'. 2-△△Ct法计算LINC00342相对GAPDH的表达量.

1.2.8 细胞转染和处理: 取2.5 mL对数期HGC-27细胞(5.0×104个/mL)接种至6孔板中, 培养24 h后, 用LipofectamineTM 2000脂质体法分别转染si-LINC00342、si-NC、pcDNA-LINC00342、pcDNA至HGC-27细胞, 转染12 h后, 更换为完全培养液. 再培养24 h, qRT-PCR检测细胞中LINC00342表达验证转染效果, 方法同1.2.8. 将转染后的HGC-27细胞均接种至培养板中, 培养4 h后, 弃培养液, 分组处理. 其中转染si-LINC00342、si-NC的HGC-27细胞均用不含连翘苷的培养液培养, 分别记为si-LINC00342组、si-NC组. 转染pcDNA-LINC00342、pcDNA的HGC-27细胞均用含20 μmol/L连翘苷的培养液培养分别记为连翘苷+pcDNA-LINC00342组、连翘苷+pcDNA组. 培养24 h后, 分别参照1.2.2-1.2.6检测细胞细胞抑制率、克隆形成数、迁移和侵袭数、细胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表达及细胞培养上清液中TNF-α和IL-6表达.

统计学处理 SPSS 22.0软件分析实验数据. 计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示, 经正态性检验和方差齐性检验后, 两组间比较行独立样本t检验; 多组间比较用单因素方差分析, 组间两两比较用LSD-t检验. 以P