转录起始不需要引物，在此期间，RNA聚合酶结合在启动子上以后，使启动子附近的DNA双链解旋并解链，以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。镁离子通过支持RNAP的活性，稳定RNAP-DNA复合物，促进NTP与RNAP的结合，在IVT过程中发挥关键作用。

一旦进入转录延伸阶段，底物NTP不断被添加到新生RNA链的3’-OH端，随着转录泡复合体与RNA聚合酶沿着DNA模板向前移动，DNA双螺旋持续解开，暴露出新的单链DNA模板，新生RNA链的3’端不断延伸，在解链区形成稳定且持续的酶伸长复合物。而在解链区的后面，DNA模板链与其原先配对的非模板链重新结合成为双螺旋，RNA链被逐步释放。

在遇到终止子序列时，RNA聚合酶和DNA模板之间的相互作用开始被破坏，转录终止。此时，RNA 链中不会继续添加互补 NTP，RNA聚合酶也不再形成新的磷酸二酯键，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来[2-3]。

02

IVT反应关键工艺参数

IVT是个复杂的动态反应过程（图2），影响因素除T7 RNAP、NTP、DNA模板以外，转录buffer中的各种成分也是制约IVT反应的关键工艺参数。

图2IVT过程的分子反应示意图（参考文献[1]）

（E-RNA聚合酶、D-DNA模板、M- RNA复合物/产物）

表1为文献已报道的部分关键工艺参数对IVT反应的影响程度。下文菌菌将依次从关键原料以及转录buffer中的逐个因素，深入梳理各参数对于IVT反应的影响情况。

表1关键工艺参数对IVT反应的影响情

注：影响等级由0~3依次变高。

2.1 DNA模板

DNA模板设计是成功转录的一个组成部分。mRNA 的 IVT 需要一个 DNA 模板，该模板使用上游 RNA 聚合酶启动子位点编码所需信息。模板可以是线性化质粒或PCR产物的形式。

转录模板必须包含 T7 RNA 聚合酶启动子序列、5'-UTR、ORF 和 3'-UTR。poly（A）尾部可以包含在质粒中，或通过PCR添加，或通过酶促多聚腺苷酸化在转录后添加。质粒设计必须包括一个独特的限制性内切酶切割位点，用于在所需 3′-末端下游进行线性化。

在IVT反应中，DNA模板浓度应该足够高，以保证不会限制反应速率，一般应使用高于 40 nM 的 DNA 浓度来保证最佳IVT生产。

图3 DNA 模板结构示例（参考文献[4]）

2.2 T7 RNAP

T7 RNA聚合酶是一种来自 T7 噬菌体的 RNA 聚合酶，可催化 DNA 以 5'→3' 方向形成 RNA。T7 聚合酶具有极高的启动子特异性，仅转录 T7 启动子下游的 DNA。如图4所示，T7线性基因组的关键基因可以分为三大类，并且这三大类基因在T7感染周期的不同阶段进行表达：I类基因在感染早期表达，为噬菌体生长建立有利条件；II类是主要参与DNA复制、蛋白编码的基因；III类基因则在噬菌体生长的后期表达，主要编码结构基因。T7RNAP 由 N 端（残基 1-325）和聚合酶（残基 326-883）结构域组成[6-7]。

为保证IVT转录比，应添加一定活性的T7 RNA聚合酶；此外，缓冲液中的pH、镁离子等也会影响T7 RNA聚合酶的活性，详见下文。

图4T7 RNA聚合酶结构（参考文献[5]）

2.3 NTP浓度

如前所述，底物浓度和辅助因子之间存在密切关系，如NTP和Mg2+形成复合物添加到新生mRNA 链中。NTP浓度必须足够高以促进反应。然而，超过一定值的浓度增加则对反应没有显著影响。

现有文献报道的数据为，NTP浓度高于7mM对mRNA的产生有积极影响。

表2不同NTP浓度下IVT反应产生mRNA的情况

2.4反应温度

现有文献尚未报道反应温度与IVT的直接关系，但温度确实会影响酶与模板启动子的结合，一般IVT反应温度应使用至少为37°C，建议在37°C~44°C之间。同时，如图5所示，高温还可以减少dsRNA的形成，降低产品的免疫原性。此外，在温度控制中应该保证良好的热传导，不完全传热会导致反应产率低，一般混合水浴是最佳选择。

图5IVT 中 dsRNA形成的示意图（参考文献[8]）

2.5 转录buffer体系中的影响因素

除了上文提到的关键原料，常用的10×转录buffer体系中也有诸多影响IVT反应的因素。10×转录buffer体系一般组成为Tris盐酸盐（Tris-HCl）、氯化镁（MgCl2）、二硫苏糖醇（DTT）、亚精胺，其中Tris-HCl buffer的pH一般为8.0（25℃）。

2.5.1 pH值

pH值反映了氢（H）离子的浓度，在IVT过程中对酶与DNA模板的结合、酶活性和RNA降解速率起着关键作用。因此，在 IVT 过程中持续监测和控制 pH 值并评估其影响至关重要。T7 RNAP 在 7.9∼ 8.1 的 pH 范围内表现出最佳活性，甚至某些野生型T7RNAP的最佳酶活性谱pH值在7.9~9.5。但在IVT反应期间以及任何下游过程中，应将pH值保持在7~8的范围内，以避免mRNA的碱性水解。如表3所示，为不同pH下，IVT反应产生mRNA的量。

表3不同pH下IVT反应产生mRNA的情况

2.5.2 Mg2+浓度与无机焦磷酸酶

Mg2+浓度被发现是有效转录的关键因素，它是T7 RNAP酶与DNA模板结合的媒介，同时Mg2+也需要与NTP复合物形成与RNA链的磷酸二酯键。当游离Mg2+浓度低于 5 mM时，转录速率和掺入的NTP的效率会大大降低。然而，Mg2+浓度过高也有利于RNA降解。一般建议浓度范围为40-60mM 以促进mRNA 的合成。

在IVT过程中，每个NTP的添加都会导致无机焦磷酸离子和质子H的释放，而无机焦磷酸盐作为反应的副产物，其可与Mg2+发生螯合而形成沉淀物焦磷酸镁（Mg2PPi），进而直接抑制反应速率。因此，为保证RNA产量，IVT反应中常需要加入无机焦磷酸酶来水解PPi，以避免无机焦磷酸盐的过多累积，并确保镁离子留在溶液中，从而优化 T7 RNAP 酶活性[9-10]。

2.5.3亚精胺

亚精胺是一种脂肪族多胺，对核酸具有高亲和力，可中和负电荷，从而促进DNA的凝聚和聚集。在IVT反应中，亚精胺在转录起始中起重要作用，可使 RNA 聚合酶从质粒模板上解离，作用于 RNA 合成的起始和延伸阶段，刺激转录反应。同时，高浓度的亚精胺也会抑制反应。一般建议浓度为1 ~ 3 mM 之间，以保证促进 mRNA 的IVT进程。

2.5.4 DTT

DTT是一种还原剂，在转录过程中对维持酶的活性起着重要作用。但现有研究表明，超过10 mM DTT不会改善较短RNA的合成。反应缓冲液需要新鲜的DTT才能获得最佳的酶活性。氧化缓冲液可能导致低产量或低 mRNA 质量，并增加截短转录本的产生。因此，一般建议将DTT分装后进行储存，或者对10×buffer采用现用现配的原则[11]。

2.6 其他影响因素

除上述因素外，反应中应避免使用反应抑制剂，如RNase和EDTA。EDTA作为Mg2+螯合剂，只在反应终止时加入。RNase应在全程避免，包括使用RNase-Free的物料，及时更换手套等。同时，也有文献报道将通过添加尿素（0.8-1.2M）也可以降低产物中的dsRNA 含量。此外，有研究发现二甲基亚砜（DMSO）可将转录效率提升高15%，但10% DMSO 对于 RNA 产量没有影响，且对于小 RNA 分子，添加 DMSO 会导致全长转录本和流产转录本生成更快[12]。

03

总结

本文从关键反应原料（DNA模板、T7 RNAP、NTP）、反应温度、转录buffer中等因素，全面梳理了IVT的重要工艺参数，便于大家快速理解IVT反应原理、并针对性地优化IVT反应体系。

当前技术下，实验室规模的IVT反应本身没有难度可言，但是如何实现产量的最大化、保证完整性和纯度，同时减少副产物的形成，以达到最佳的反应工艺，这其中为摸索IVT关键工艺参数、交叉影响因素而涉及的实验次数就显得非常庞杂、数量巨大。

参考文献

[1] K. Wang, W. Xie and H. Zheng, "Stochastic Molecular Reaction Queueing Network Modeling for in Vitro Tranion Process," 2023 Winter Simulation Conference (WSC), San Antonio, TX, USA, 2023, pp. 1900-1911.

[2]Kochetkov SN, Rusakova EE, Tunitskaya VL. Recent studies of T7 RNAPolymerase mechanism. FEBS Lett. 1998 Dec 4;440(3):264-7.

[3]Arnaud-Barbe N, Cheynet-Sauvion V, Oriol G, Mandrand B, Mallet F. Tranion of RNA templates by T7 RNAPolymerase. Nucleic Acids Res. 1998 Aug 1;26(15):3550-4.

[4]Henderson JM, Ujita A, Hill E, Yousif-Rosales S, Smith C, Ko N, McReynolds T, Cabral CR, Escamilla-Powers JR, Houston ME. Cap 1 Messenger RNA Synthesis with Co-tranional CleanCap® Analog by In Vitro Tranion. Curr Protoc. 2021 Feb;1(2):e39.

[5]Borkotoky S, Kumar Meena C, Bhalerao GM, Murali A. An in-silico glimpse into the pH dependent structural changes of T7 RNAPolymerase: a protein with simplicity. Sci Rep. 2017 Jul 24;7(1):6290.

[6]Arnaud-Barbe N, Cheynet-Sauvion V, Oriol G, Mandrand B, Mallet F. Tranion of RNA templates by T7 RNAPolymerase. Nucleic Acids Res. 1998 Aug 1;26(15):3550-4.

[7]Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin CT. 3' end additions by T7 RNAPolymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character-RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Res. 2018 Oct 12;46(18):9253-9263.

[8] Wu MZ, Asahara H, Tzertzinis G, Roy B. Synthesis of low immunogenicity RNA with high-temperature in vitro tranion. RNA. 2020 Mar;26(3):345-360.

[9] Kern JA, Davis RH. Application of solution equilibrium analysis to in vitro RNA tranion. Biotechnol Prog. 1997 Nov-Dec;13(6):747-56.

[10] Kern JA, Davis RH. Application of a fed-batch system to produce RNA by in vitro tranion. Biotechnol Prog. 1999 Mar-Apr;15(2):174-84.

[11]Rosa SS, Nunes D, Antunes L, Prazeres DMF, Marques MPC, Azevedo AM. Maximizing mRNA vaccine production with Bayesian optimization. Biotechnol Bioeng. 2022 Nov;119(11):3127-3139.

[12]Francis C, Frida J P, Thanh-Huong B, Alicja M, Artem K, Jérémie P, Sven Even B. Urea supplementation improves mRNA in vitro tranion by decreasing both shorter and longer RNA byproducts. RNA Biol. 2024 Jan;21(1):1-6.

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