转录组分析1

2023-08-11 10:20| 来源: 网络整理| 查看: 265

Counts值

对给定的基因组参考区域，计算比对上的read数，又称为raw count（RC）。计数结果的差异的影响因素：落在参考区域上下限的read是否需要被统计，按照什么样的标准进行统计。

RNA-Seq的数据，目前普遍是使用counts数据进行差异分析，但是counts数据进行差异分析就要对counts数据进行标准化。目前生信公司普遍使用DESeq、DESeq2和edger等R包，以counts数据作为输入进行差异分析，其程序内部会对counts数据进行数据标准化。短读长与长读长RNA-seq平台 image.png

RNA-Seq主要有三个步骤，分别是第一：建库；第二，测序；第三，数据分析

上游分析的基本流程 image.png 转录组数据分析准备工作 # 创建名为rna的小环境 conda create -n rna python=3 # 激活小环境 conda activate rna # 安装软件 conda install -y sra -tools # 批量安装 conda install -y sra -tools fastqc hisat2 trim -galore subread multiqc samtools salmon # 退出小环境 conda deactivate 示例数据集：GSE52778

1、先登录界面找到这个数据集所在位置： https://www.ncbi.nlm.nih.gov//geo/query/acc.cgi?acc=GSE52778 2、点击SRA Run selector

image.png 3、点击Accession List:会出来一个txt文件，列表和下方表格是一样的 image.png image.png

补充知识点： Short Read Archive（SRA）(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)是NCBI 提供的数据存储服务，储存海量的公开的高通量测序数据。 • NCBI BioProject：PRJN ****（例如：PRJNA229998）包含单一研

究计划的总体描述；项目通常涉及多个样本和数据集。 • NCBI BioSample：SAMN ****和/或SRS ****（例如： SAMN02422669）描述生物来源材料；每个物理上独特的标本应注册为具有一组独特属性的单个BioSample。 • SRA实验：SRX ****是特定样品的独特测序文库（SRX384345） • SRA Run：SRR ****或ERR ****（例如：SRR1039508）是链接到给定测序库（实验）的数据文件的清单。 🤭我们需要把SRA文件转换为Fastq文件才能进行后续的分析

SRA

NCBI有专门针对SRA数据的工具包，就是箭头所指的SRA Toolkit，可以下载SRA文件

还有一种下载方式就是从ENA下载： ENA:https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home image.png image.png image.png

参考：https://mp.weixin.qq.com/s/G4UQNUNXqOzeLVypOJIf6Q

第3种下载方式：SRA Explorer 网址：https://sra-explorer.info/ image.png image.png image.png 点击SRR1039508之后会自动跳转NCBI SRA的网页 image.png image.png image.png image.png 下载方式不推荐从NCBI的SRA下载，更推荐用ENA或者是SRA Explorer

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image.png 上游分析就是从SRA开始，然后用fastq-dump转换成fastq文件，然后对fastq文件进行过滤，去掉低质量的reads，以及接头，然后获得clean reads，然后再把clean reads比对（mapping:比对）回参考基因组，比对完成之后，会得到sam，把sam文件转换成bam文件再对bam文件进行计数，也就是counts，就会得到基因的表达矩阵，然后读入R就可以做下游分析了。创建工作目录后面就可以直接用代码进行分析了

小贴士：prefetch命令下载数据是非常慢的，所以推荐用Aspera下载，它的下载速度最高可以达到好几百MB/s，但是因为这个速度非常快，如果用云服务器可能会被官方强制下线。。所以可以用自己的实体服务器来下载运行命令是：ascp

常用参数注意 Fastq格式：测序得到的是带有质量值的碱基序列(fastq格式) 有4行每行的意思质量评估软件：FastQC软件

FastQC软件可以对fastq格式的原始数据进行质量统计，评估测序结果，为下一步修剪过滤提供参考。

FastQC主页：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ image.png image.png FastQC实际运行命令

对单个FastQ文件进行质量评估：

image.png

批处理，对所有FastQ文件进行质量评估：

image.png 测序数据的质量评估结果 image.png image.png image.png 使用MultiQC整合FastQC质量评估结果 MultiQC官网：https://multiqc.info/ image.png

MultiQC的主要参数： --help # 打印MultiQC的帮助信息 -o / --outdir # 指定输出文件夹。

image.png 然后在Xshell中就可以点击xftp下载这两个文件到本地查看原始数据的修剪/过滤

过滤标准： • 去除碱基质量值低于20的reads • 去除N比例高于百分之5的reads • 去除Index或接头 • 去除一些reads的head或tail 数据过滤的软件：cutadapter，trimmomatic， trim_galore，fastp 质量控制的重要性：https://www.jianshu.com/p/7a3de6b8e503

FastQ质量控制推荐两个网站： 1、trim_galore官网：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ image.png 先用命令下载trim_galore然后使用--help查看帮助文档 image.png image.png 2、fastp image.png image.png image.png trim_galore的转录组结题报告

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