背景技术：

4.过继性免疫疗法已经上升到癌症治疗方法的前沿。可以对t细胞进行工程化改造以表达识别肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体(car)的基因。car是经工程化改造的免疫受体，可以对t细胞进行重定向从而选择性地杀死肿瘤细胞。它们用于癌症免疫治疗的总体前提是快速产生靶向肿瘤的t细胞。

技术实现要素：

5.理想的基因递送系统应易于生产、易于施用并且对正常细胞无毒，其通过血液流动将遗传信息有效地、特异性地递送到靶标组织，并将遗传物质整合到宿主细胞中，从而使转基因稳定地表达。本文描述的新系统符合这个规定。1.本公开提供了一种重组载体，所述重组载体包含：(a)编码嵌合抗原受体(car)的多核苷酸；以及(b)包含至少一个mirna靶向序列的多核苷酸，其中，(a)和(b)连接在相同多核苷酸上。在一个实施方式中，载体还包含(c)编码细胞毒性多肽的多核苷酸，所述细胞毒性多肽将前药转化为细胞毒性药物。在另一个实施方式中，(a)包含：编码一个以上抗原结合结构域的第一多核苷酸结构域；可选的编码连接子的多核苷酸结构域；可操作地连接到第一多核苷酸结构域的第二多核苷酸结构域，其中，第二多核苷酸结构域编码跨膜结构域；以及编码胞内信号结构域的第三多核苷酸结构域。在一个进一步的实施方式中，第一多核苷酸结构域编码抗体片段、单域抗体、单链可变片段、单域抗体、骆驼科vhh结构域、非免疫球蛋白抗原结合支架、受体或受体片段、或双特异性抗体。在另一个实施方式中，可选的编码连接子的多核苷酸编码gly3序列。在又一个实施方式中，跨膜结构域来自选自如下的成员：t细胞受体的α链、β链或ζ链、cd3γ、cd3ε、cd3δ、cd28、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、kirds2、ox40、cd2、cd27、lfa-1(cd11a，cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd40、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrfl)、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7ra、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、dnam1(cd226)、slamf4(cd244，2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、slamf6(ntb-a，lyl08)、slam(slamf1，cd150，ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d和/或nkg2c。在又一个实施方式中，第三多核苷酸结构域编码胞内信号结构域，所述胞内信号结构域选自如下：cd3ζ、共用ferγ(fcer1g)、feγriia、ferβ(feεr1b)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dap10和dap12。在一个实施方式中，将前药转化为细胞毒性药物的细胞毒性多肽选自如下：具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽、具有胸苷激酶活性的多肽和它们的组合。在任何前述实施方式中，载体为整合载体。在一个进一步的实施方式中，载体为逆转录病毒载体。在一个更进一步的实施方式中，逆转录病毒载体为非复制型γ逆转录病毒载体。在另一个实施方式中，至少一个mirna靶向序列与mirna结合，所述mirna选自如下：hsa-mir-223-3p、hsa-mir143-3p、hsa-mir182-5p、hsa-mir-10bp、hsa-mir141-3p、has-mir486-5p和前述的任意组合。2.本公开还提供了重组逆转录病毒颗粒，所述重组逆转录病毒颗粒包含：gag多肽、pol多肽、env多肽以及包含在逆转录病毒载体衣壳内的逆转录病毒多核苷酸；其中，所述逆转录病毒多核苷酸从5'到3'包含：(r-u5结构域)-(可选的信号肽编码序列结构域)-(结合结构域编码序列结构域)-(可选的铰链/连接子编码序列结构域)-(跨膜(tm)编码序列结构域)-(mirna靶结构域)-(u3-r结构域)。在一个实施方式中，r-u5结构域具有与seq id no：25的核苷酸1至约核苷酸145具有至少80％同一性的序列。在另一个或进一步的实施方式中，结合结构域编码序列之前具有信号序列。在又一个或进一步的实施方式中，结合结构域编码序列之后具有可选的连接子/间隔子结构域序列。在又一个或进一步的实施方式中，逆转录病毒多核苷酸还包含杀伤开关结构域编码序列。在一个进一步的实施方式中，杀伤开关编码结构域包含ires，所述ires可操作地连接至将前药转化为细胞毒性药物的多肽的编码序列。在一个进一步的实施方式中，多肽具有胸苷激酶(tko)活性或胞嘧啶脱氨酶(cd)活性。在另一个实施方式中，逆转录病毒多核苷酸包含至少一个mirna靶向序列。在一个进一步的实施方式中，至少一个mirna靶向序列包含多个mirna靶向序列。在一个更进一步的实施方式中，多个mirna靶向序列是相同的。在又一个实施方式中，多个mirna靶向序列中的至少两个是不同的。在另一个实施方式中，u3-r结构域包含与seq id no：25的约核苷酸5537至约核苷酸6051具有至少80％同一性的序列。3.本公开还提供了一种携带基因转导干细胞的非人动物，所述非人动物通过使用本公开载体的体内转导产生。附图说明4.图1是工程化改造的rnv的示意图，其用于递送具有或不具有不同3'utr microrna靶序列的car或gfp转基因。示例包括mir233(引起单核细胞中转录物的降解)；或mirabct和mirankt(分别引起b细胞和nk细胞中转录物的降解)。按照1-4倍和不同组合添加这些靶序列，以引导单核细胞、b细胞和nk细胞中的转基因降解。5.图2是工程化改造的rnv的示意图，其用于递送具有或不具有不同3'utr microrna3p是一种microrna，其仅在单核细胞或骨髓细胞中以显著的浓度产生。(a)所需结果的概念图。(b)显示了原始gfp载体(左栏)、gfp mir 223-3p载体(中栏)和具有mirabc的无关mirna靶标的gfp载体在u937单核细胞系中的表达，结果显示与其他两种载体相比，gfpmir223感染的细胞系中gfp表达降低了190-100倍。所有三种载体在ht1080纤维肉瘤细胞或其他非单核细胞中产生等量的gfp。14.图11提供了抗bcma-car rnv结构的示意图。15.图12显示了mirna表达鉴定的箱线图示例。16.图13显示了mirna表达去靶向的示例。该图显示了原始gfp载体(左栏)、gfp mir 223-3p载体(中栏)和具有mirabc的无关mirna靶标的gfp载体在u937单核细胞系中的表达，结果显示与其他两种载体相比，gfpmir223感染的细胞系中gfp表达降低了100倍。17.图14显示了经过修饰从而包含以两个方向插入env序列的富含脯氨酸区域的的抗cd8 scfv序列的4070a兼嗜性包膜。使用mulv和慢病毒假型，细胞特异性靶向cd34+造血干细胞的替代性嵌合病毒包膜的使用。靶淋巴细胞的慢病毒载体的假型已在文献中进行了讨论(frank等，(2019)surface-engineered lentiviral vectors for selective gene transfer into subtypes of lymphocytes，mol.ther.(第12卷))。利用麻疹和尼帕病毒系统的双重靶向和融合功能产生了主要的嵌合假型。对于病毒的细胞受体附着，麻疹病毒编码血凝素-神经酰胺酶(hn)以附着到唾液酸受体上；糖蛋白(g)和血凝素(h)用于附着到蛋白质受体上。18.图15a-b显示了(a)pba-9b载体与小鼠cd19car构建体(基于与铰链-tm和信号结构域连接的抗小鼠cd19-1d3的scfv单克隆抗体)的前病毒整合形式，或(b)pba-9b载体与人cd19car构建体(基于与铰链-tm和信号结构域连接的抗人cd19-fmc63的scfv单克隆抗体)的前病毒整合形式。19.图16提供了用于下调骨髓、b细胞和nk细胞中car序列表达的microrna靶序列。20.图17提供了sin载体设计的示例，其使用具有ef1a增强子的组成型cmv启动子驱动表达，以确保人抗cd19 car序列的表达。该载体包含内部核糖体进入位点(ires)序列，用于表达人密码子优化的胸苷激酶(tko)基因或酵母胞嘧啶脱氨酶基因(ycd2)以作为载体杀伤开关(当暴露于其相应的前药时)，之后是用于增强感兴趣基因表达的土拨鼠肝炎病毒的转录后调控元件(wpre)。21.图18a-d显示了包含针对(a)ccr5、(b)ccr2、(c)ccr5和ccr2、和(d)ccr5和ccr2的crispr/cas9系统的逆转录病毒构建体，其中crispr/cas9由内部启动子驱动。22.图19a-d显示了逆转录病毒构建体(a-d)，其通过阻断hiv共受体ccr5和ccr2的活性来治疗hiv感染或多发性硬化症。23.图20a-d显示了逆转录病毒构建体(a-d)，其使用hiv共受体ccr5和ccr2的sirna治疗hiv感染或多发性硬化症。24.图21显示了逆转录病毒构建体，其使用针对ccr5和ccr2的crispr/cas系统治疗hiv感染或多发性硬化症。25.图22显示了在体内动员和转导造血干细胞/祖细胞(hspc)的方案中采用的时间线。26.图23显示了在动员的balb/c小鼠中rnv-gfp转导2小时。在培养3天后收获脾细胞并通过facs分析和methocult测定法检查hspc的gfp转导。facs分析后拍摄的显微照片(上图显示了紫外光下的gfp+细胞，下图显示了相衬)。具体实施方式27.如本文和所附权利要求中使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提到“受试者”时包括多个此种受试者，提到“载体”时包括提到本领域技术人员已知的一种以上载体及其等效物，等等。28.此外，除非另有说明，否则“或”的使用是指“和/或”。类似地，“包含”、“含有”、“含”、“包括”、“涵盖”和“具有”可以互换并且不旨在是限制性的。29.还应理解，在各种实施方式的描述中使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员将理解在一些具体情况下，可以替代性地使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”来描述实施方式。30.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。以下文献为本领域技术人员提供了本技术中使用的许多术语的一般指南：allen等,remington:the science and practice of pharmacy第22版，pharmaceutical press(2012年9月15日)；hornyak等，introduction to nanoscience and nanotechnology,crc press(2008)；singleton和sainsbury，dictionary of microbiology and molecular biology第3版，修订版，j.wiley;sons(纽约，纽约州2006)；smith，march’s advanced organic chemistry reactions,mechanisms and structure第7版，j.wiley;sons(纽约，纽约州2013)；singleton，dictionary of dna and genome technology第3版，wiley-blackwell(2012年11月28日)；以及green和sambrook，molecular cloning:a laboratory manual第4版，cold spring harbor laboratory press(冷泉港，纽约州2012)。有关如何制备抗体的参考资料，参阅：greenfield，antibodies a laboratory manual第2版，cold spring harbor press(冷泉港，纽约州2013)；和milstein，derivation of derived from antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion,eur.j.immunol.，1976年7月，6(7)：511-9；queen和selick，humanized immunoglobulins，美国专利号5,585,089(1996年12月)；以及riechmann等，reshaping human antibodies for therapy,nature，1988年3月24日，332(6162)：323-7。本文提供的所有标题和副标题仅是为了便于阅读，不应解释为限制本发明。尽管与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和具体实施例仅是说明性的而非限制性的。31.为了描述和公开方法的目的，本文提及的所有出版物均通过引用整体并入本文，其可与本文描述结合使用。此外，对于一个以上出版物中出现的与本公开中明确定义的术语相似或相同的任何术语，在各方面都以本公开中明确提供的术语定义为准。32.应当理解，本公开不限于本文所述的具体方法、方案和试剂等，因而可以变化。本文使用的术语仅为了描述具体实施方式或方面的目的，并不旨在限制本公开的范围。33.除了在操作实施例或其他地方另有说明的，本文使用的所有表示成分数量或反应条件的数字都应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。在使用术语“约”描述本发明时，与百分比有关的是指±1％。如本文所用，术语“约”可以表示在本领域普通技术人员所确定的具体值的可接受的误差范围内，这可以部分取决于如何测量或确定该值，例如测量系统的局限性。或者，“约”可以表示给定值的正负20％、正负10％、正负5％或正负1％的范围。或者，具体与生物系统或生物过程相关时，该术语可以表示在值的1个数量级以内、5倍以内或2倍以内。在申请和权利要求中描述了具体值的情况下，除非另有说明，否则可以认为术语“约”表示在具体值的可接受误差范围内。此外，在提供了值的范围和/或子范围的情况下，范围和/或子范围可以包括该范围和/或该子范围的端点。在一些情况下，变化可以包括指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或者甚至0.1％的量或浓度。34.对于本文中数字范围的叙述，明确涉及其间具有相同精确度的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外，还涉及数字7和8；对于范围6.0-7.0，明确涉及数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。35.可以使用逆转录病毒科病毒创建载体，该载体整合到它们的宿主基因组中并为转导细胞及其后代提供长期的基因表达。通常，γ逆转录病毒载体、慢病毒载体和泡沫病毒载体适用于并且有益于转导细胞(包括动员的干细胞)。本公开关注γ逆转录病毒载体，但本领域技术人员将很快认识到本发明可以使用所有类型的整合载体，包括病毒和非病毒载体，例如腺病毒-逆转录病毒杂交体、piggy-bac转座子和睡美人(sleeping beauty)转座子等。本公开提供了通过直接施用载体而在体内转导细胞(包括造血干细胞)以在多种疾病中实现治疗效果的组合物和方法，所述多种疾病包括遗传病、癌症、感染性疾病和自身免疫疾病。在一些实施方式中，可以在体内感染之前动员细胞。36.本公开载体构建体可以被认为用下述结构域(有时称为盒)组装。通常，载体包含长末端重复序列、结合结构域、铰链或连接子结构域、跨膜结构域、胞内结构域、一个或多个mirna靶结构域、可选的杀伤开关结构域和可选的细胞活性调节结构域。结合结构域、铰链/连接子、跨膜结构域和胞内结构域通常包含嵌合抗原受体(car)，该嵌合抗原受体包括第一代、第二代、第三代和相关构建体。37.如本文所用，术语“抗体”是指衍生自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是单克隆的或多克隆的，多链或单链的，或完整的免疫球蛋白，以及可以衍生自天然来源或重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。抗体可以是“人源化的”、“嵌合的”或非人的。38.术语“抗体片段”是指抗体的至少一部分，该部分保留了与抗原表位特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力。抗体片段的示例包括但不限于fab、fab'、fv片段、scfv抗体片段、二硫键连接的fv、由vh结构域和ch1结构域组成的fd片段、线性抗体、单域抗体(sdab)(例如vl或vh)、骆驼科vhh结构域、由抗体片段形成的多特异性抗体(例如包含在铰链区通过二硫键连接的两个fab片段的二价片段)，以及分离的cdr或其他抗体表位结合片段。可以将抗原结合片段加入单域抗体、大抗体(maxibody)、微抗体(minibody)、纳米抗体、内抗体(intrabody)、双抗体、三抗体、四抗体、v-nar和双-scfv(参见，例如，hollinger和hudson，nature biotechnology 23：1126-1136,2005)。还可以将抗原结合片段移植到基于多肽的支架(例如iii型纤连蛋白(fn3))中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微抗体)。39.术语“抗体重链”是指以天然存在构象存在于抗体分子中的两种多肽链中较大那种，其通常决定抗体所属的类别。40.术语“抗体轻链”是指以天然存在构象存在于抗体分子中的两种多肽链中较小那种。kappa(κ)和lambda(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。[0041]“抗癌剂”是指抑制异常细胞分裂和生长、抑制肿瘤细胞迁移、抑制侵袭或防止肿瘤生长和转移的药剂。该术语包括化疗剂、生物剂(例如sirna、病毒载体(例如工程化改造的mlv)、腺病毒、递送细胞毒性基因的疱疹病毒)、抗体等。[0042]术语“抗癌作用”是指可以通过多种方式表现的生物学效应，包括但不限于减小肿瘤体积、减少癌细胞数量、减少转移灶数量、增加预期寿命、降低癌细胞增殖、降低癌细胞存活、或者改善各种与癌症病况相关的生理症状。“抗癌作用”也可以表现为car在首先预防癌症发生方面的能力。[0043]术语“抗原”或“ag”是指引起免疫反应的分子。这种免疫反应可以包括抗体的产生，或特定免疫活性细胞的激活，或抗体的产生和特定免疫活性细胞的激活。本领域技术人员将将理解，任何大分子(包括几乎所有的蛋白质或肽)都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组dna或基因组dna。因此，本领域技术人员将理解，包含编码引起免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna编码如本文所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。本公开包括但不限于使用超过一种基因的部分核苷酸序列并且将这些核苷酸序列以各种组合进行排列从而编码引发所需免疫反应的多肽。此外，本领域技术人员将理解抗原完全不需要由“基因”编码。显而易见地，可以合成产生抗原，或者抗原可以衍生自生物样品，或者可以是除多肽之外的大分子。此类生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物成分的流体。[0044]可以靶向的抗原的非限制性示例包括：cd5、cd19、cd20、cd22、cd24、cd30、cd33、cd34、cd38、cd72、cd97、cd123、cd171、cs1(也称为cd2子集1、cracc、mpl、slamf7、cd319和19a24)、c型凝集素样分子-1(cll-1或clecl1)、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂gd3(aneu5ac(2-8)aneu5ac(2-3)bdgalp(l-4)bdglcp(l-l)cer)、tnf受体家族成员b细胞成熟抗原(bcma)、tn抗原((tn ag)或(galnacα-ser/thr))、前列腺特异性膜抗原(psma)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、fms样酪氨酸激酶3(flt3)、肿瘤相关糖蛋白72(tag72)、cd44v6、糖基化cd43表位、癌胚抗原(cea)、上皮细胞粘附分子(epcam)、b7h3(cd276)、kit(cd117)、白细胞介素13受体亚基α-2(il-13ra2或cd213a2)、间皮素、白细胞介素11受体α(il-11ra)、前列腺干细胞抗原(psca)、蛋白酶丝氨酸21(testisin或prss21)、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)、lewis(y)抗原、血小板衍生生长因子受体β(pdgfr-β)、阶段特异性胚胎抗原4(ssea-4)、叶酸受体α(fra或fr1)、叶酸受体β(frb)、受体酪氨酸蛋白激酶erbb2(her2/neu)、细胞表面相关粘蛋白1(muc1)、表皮生长因子受体(egfr)、神经细胞粘附分子(ncam)、前列腺酶(prostase)、前列腺酸性磷酸酶(pap)、延伸因子2突变型(elf2m)、肝配蛋白b2、成纤维细胞活化蛋白α(fap)、胰岛素样生长因子1受体(igf-i受体)、碳酸酐酶ix(calx)、蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基β型9(lmp2)、糖蛋白100(gpl00)、由断点簇区(bcr)和abelson小鼠白血病病毒致癌基因同源物1(abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)、酪氨酸酶、肝配蛋白a型受体2(epha2)、唾液酸化lewis粘附分子(sle)、神经节苷脂gm3(aneu5ac(2-3)bdclalp(l-4)bdglcp(l-1)cer)、转谷氨酰胺酶5(tgs5)、高分子量黑色素瘤相关抗原(hmwmaa)、o-乙酰基-gd2神经节苷脂(oacgd2)、肿瘤内皮标志物1(tem1/cd248)、肿瘤内皮标志物7相关(tem7r)、密封蛋白6(cldn6)、促甲状腺激素受体(tshr)、g蛋白偶联受体c类5组成员d(gprc5d)、x染色体开放阅读框61(cxorf61)、cd179a、间变性淋巴瘤激酶(alk)、聚唾液酸、胎盘特异性1(plac1)、globoh糖神经酰胺的己糖部分(globoh)、乳腺分化抗原(ny-br-1)、尿溶蛋白(uroplakin)2(upk2)、甲型肝炎病毒细胞受体1(havcr1)、肾上腺素受体β3(adrb3)、泛连接蛋白3(panx3)、g蛋白偶联受体20(gpr20)、淋巴细胞抗原6复合物基因座k9(ly6k)、嗅觉受体51e2(or51e2)、tcrγ可变阅读框架蛋白(tarp)、肾母细胞瘤蛋白(wt1)、癌症/睾丸抗原1(ny-eso-1)、癌症/睾丸抗原2(lage-1a)、黑色素瘤相关抗原1(mage-a1)、位于染色体12p上的ets易位变体基因6(etv6-aml)、精子蛋白17(spa17)、x抗原家族成员la(xage1)、血管生成素结合细胞表面受体2(tie 2)、黑色素瘤癌睾丸抗原-1(mad-ct-1)、黑色素瘤癌睾丸抗原-2(mad-ct-2)、fos相关抗原1、肿瘤蛋白p53(p53)、p53突变体、prostein、生存素、端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(pct a-1或半乳凝素8)、t细胞识别的黑色素瘤抗原1(melana或marti)、大鼠肉瘤(ras)突变体、人端粒酶逆转录酶(htert)、肉瘤易位断点、黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ml-iap)、erg(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(tmprss2ets融合基因)、n-乙酰氨基葡萄糖转移酶v(na17)、配对盒蛋白pax-3(pax3)、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、v-myc禽骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(mycn)、ras同源物家族成员c(rhoc)、酪氨酸酶相关蛋白2(trp-2)、细胞色素p450 lb 1(cyplb 1)、ccctc-结合因子(锌指蛋白)-样(boris或印记位点调节物兄弟因子(brother of the regulator of imprinted sites))、t细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(sart3)、配对盒蛋白pax-5(pax5)、前顶体素结合蛋白sp32(oy-tes1)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lck)、a激酶锚定蛋白4(akap-4)、滑膜肉瘤x断点2(ssx2)、晚期糖基化终产物受体(rage-1)、肾ubiquitous 1(ru1)、肾ubiquitous 2(ru2)、豆荚蛋白(legumain)、人乳头瘤病毒e6(hpv e6)、人乳头瘤病毒e7(hpv e7)、肠羧基酯酶、热休克蛋白70-2突变型(mut hsp70-2)、cd79a、cd79b、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(lair1)、iga受体的fc片段(fcar或cd89)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族a成员2(lilra2)、cd300分子样家族成员f(cd300lf)、c型凝集素结构域家族12成员a(clec12a)、骨髓基质细胞抗原2(bst2)、含有egf样模块的粘蛋白样激素受体样2(emr2)、淋巴细胞抗原75(ly75)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)3(gpc3)、fc受体样5(fcrl5)、免疫球蛋白λ样多肽1(iglll)、mpl、生物素、c-myc表位标签、lamp1 trop2、gfrα4、cdh17、cdh6、nybr1、cdh19、cd200r、slea(ca19.9、唾液酸化lewis抗原)、岩藻糖基-gm1、ptk7、gpnmb、cdh1-cd324、dll3、cd276/b7h3、il11ra、il13ra2、cd179b-igll1、tcrγ-δ、nkg2d、cd32(fcgr2a)、tn抗原、tim1-/hvcr1、csf2ra(gm-csfr-α)、tgfβr2、lews抗原、tcr-β1链、tcr-β2链、tcr-γ链、tcr-δ链、fitc、黄体生成激素受体(lhr)、促卵泡激素受体(fshr)、促性腺激素受体(cghr或gr)、ccr4、gd3、slamf6、slamf4、hiv1包膜糖蛋白、htlv1-tax、cmv pp65、ebv-ebna3c、kshv k8.1、kshv-gh、甲型流感血凝素(ha)、gad、pdl1、鸟苷酸环化酶c(gcc)、桥粒芯蛋白3(dsg3)的自身抗体、桥粒芯蛋白1(dsg1)的自身抗体、hla、hla-a、hla-a2、hla-b、hla-c、hla-dp、hla-dm、hla-doa、hla-dob、hla-dq、hla-dr、hla-g、ige、cd99、ras g12v、组织因子1(tf1)、afp、gprc5d、密封蛋白18.2(cld18a2或cldn18a.2)、p-糖蛋白、steap1、liv1、连接蛋白(nectin)4、cripto、gpa33、bst1/cd157、低电导氯离子通道和tnt抗体识别的抗原。[0045]“抗原结合结构域”是指由于其一级、二级或三级序列、翻译后修饰和/或电荷以高度特异性与抗原结合的多肽或肽。抗原结合结构域可以衍生自不同来源，例如，抗体(全长重链、fab片段、单链fv(scfv)片段、二价单链抗体或双抗体)、非免疫球蛋白结合蛋白、配体或受体。然而，有许多促进免疫反应的替代物，例如连接的细胞因子(导致识别带有细胞因子受体的细胞)、亲和体(affibody)、来自天然存在的受体的配体结合结构域、受体(例如在肿瘤细胞上)的可溶性蛋白质/肽配体、肽和疫苗，它们各自可用于本公开的各种实施方式中。在一些实施方式中，如本领域技术人员将理解的，几乎任何以高亲和力结合给定同源物或抗原的分子都可以用作抗原结合结构域。在一些实施方式中，抗原结合结构域包含t细胞受体(tcr)或其部分。[0046]术语“抗感染作用”是指可以通过多种方式表现的生物学效应，包括但不限于例如降低感染原滴度、减少感染原集落计数、改善各种与感染病况相关的生理症状。[0047]术语“抗肿瘤作用”或“抗癌作用”是指可以通过多种方式表现的生物学效果，包括但不限于例如减小肿瘤体积、减少肿瘤细胞数量、降低肿瘤细胞增殖、抑制转移或降低肿瘤细胞存活。[0048]如本文所用，“有益结果”可包括但不限于减轻或缓解疾病状况的严重性、防止疾病状况恶化、治愈疾病状况、防止疾病状况发展、降低患者或受试者疾病状况发展的机会，以及延长患者或受试者的寿命或预期寿命。作为非限制性示例，“有益结果”可以是一种以上症状的缓解、缺陷程度的减少、癌症进展的稳定状态(即，不恶化)、转移或侵袭的延迟或减慢，以及改善或减轻与癌症相关的症状。[0049]如本文所用，术语“其生物等效物”在涉及参考蛋白质、抗体或其片段、多肽或核酸时旨在与“其等效物”同义，是指具有最小的同源性同时仍保持所需结构和/或功能的那些物质。例如，等效物是指至少约70％的同源性或同一性，或者至少80％的同源性或同一性，或者可替代地至少约85％，或者可替代地至少约90％，或者可替代地至少约95％，或者可替代地至少98％的同源性或同一性，并表现出与参考蛋白质、多肽、抗体或其片段或核酸基本等效的生物活性。或者，当涉及多核苷酸时，该多核苷酸的等效物是在严格条件下与参考多核苷酸或其互补链杂交并且具有相同生物学功能(例如，结合特定mirna或编码的蛋白质或多肽具有与比较的多核苷酸相同或相似的生物学效应)的多核苷酸。或者，当涉及多肽或蛋白质时，该多肽或蛋白质的等效物是在严格条件下与编码参考多肽或蛋白质的多核苷酸或其互补链杂交的多核苷酸所表达的多肽或蛋白质。[0050]“癌症”和“癌”是指或描述哺乳动物的生理状况，其特征通常是不受调节的细胞生长。癌症的示例包括但不限于b细胞淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和/或非霍奇金淋巴瘤)、t细胞淋巴瘤、骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖疾病(例如真性红细胞增多症、骨髓纤维化、原发性血小板增多症等)、皮肤癌、脑肿瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、肛门癌、原发部位不明癌、内分泌癌、睾丸癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、生殖器官癌、甲状腺癌、肾癌、恶性上皮肿瘤、黑色素瘤、头颈癌、脑癌(例如多形性胶质母细胞瘤)、前列腺癌(包括但不限于雄激素依赖性前列腺癌和雄激素非依赖性前列腺癌)和白血病。在本领域中，很容易识别其他的癌症和细胞增殖疾病。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语都涵盖实体瘤和液体瘤(例如扩散的或循环的肿瘤)。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前的以及恶性的癌症和肿瘤。术语“癌症”意在包括所有类型的癌生长或致癌过程、转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭阶段。[0051]术语“细胞活性调节结构域”是指如下分子中的任意一种以上：在免疫细胞(例如t细胞，例如car-t细胞等)中表达以降低、调节或修饰该免疫细胞活性的pdl1、pdl2、cd80、cd86、crma、p35、nemo-k277a(或其衍生物)、k13-opt、ikk2-ss/ee、ikk1-ss/ee、41bbl、cd40l、vflip-k13、mc159等以及它们的组合。在一些实施方式中，辅助模块与免疫受体(例如car)共表达以增加、减少、调节或修饰car或表达car的细胞的表达或活性。辅助模块可以使用单个载体或使用两个以上不同载体与car共表达。[0052]“化疗剂”是已知可用于癌症化疗的化合物。化疗剂的非限制性示例可以包括：烷化剂类，例如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐类，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；喜树碱类，包括合成类似物拓扑替康(topotecan)；苔藓抑素(bryostatin)；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、氯萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧化氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀(uracil mustard)；亚硝基脲类(nitrosurea)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如烯二炔类抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γ1i和卡奇霉素ωi1(参见例如agnew,chem.intl.ed.engl.,33:183-186(1994))、达内霉素(dynemicin)(包括达内霉素a)、双膦酸盐类(例如氯膦酸盐)、埃斯培拉霉素(esperamicin)以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关的色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克那霉素(acclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素c(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、间柔比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马赛霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(例如丝裂霉素c)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，例如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂类，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝他布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elformithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美坦辛类(maytansinoid)，例如美坦辛(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；多糖复合物(jhs natural products,eugene,oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐呋喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三乙胺醌；2,2',2”‑三氯三乙胺；单端孢霉烯类，特别是t-2毒素、疣孢菌素a(verracurin a)、杆孢菌素a(roridin a)和蛇形菌素(anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“ara-c”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(bristol-myers squibb oncology,princeton,nj)、cremophor-free、白蛋白工程化的紫杉醇纳米颗粒制剂(american pharmaceutical partners,schaumberg,il)和多西他赛(doxetaxel)(rhone-poulenc rorer，antony，法国)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；navelbine；长春瑞滨(vinorelbine)、诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(camptosar，cpt-11)；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类视黄醇类，例如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(lv)；奥沙利铂；拉帕替尼(tykerb)；降低细胞增殖的pkc-α、raf、h-ras、egfr(例如厄洛替尼和vegf-a的抑制剂，以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物或它们的组合。[0053]“嵌合抗原受体”(car)是人工(非天然存在的)免疫细胞(例如t细胞)受体，预期用作癌症、自身免疫疾病和感染性疾病的疗法，使用称为过继性细胞移植的技术。car也被称为人工t细胞受体、嵌合t细胞受体或嵌合免疫受体。car被构建为特异性地刺激t细胞活化和增殖，以响应该car结合的特定抗原。通常，car是指一组多肽，在最简单的实施方式中通常是两个，当在免疫效应细胞中表达时，它为细胞提供针对靶抗原或靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并产生胞内信号。在一些实施方式中，car至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号结构域(在本文中也被称为“胞内信号结构域”)，包含衍生自刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号结构域。在一些实施方式中，该组多肽彼此邻接。在一个实施方式中，car包含在car融合蛋白的氨基末端(n末端)的可选的前导序列。在一个实施方式中，car还包含在胞外抗原结合结构域的n末端的前导序列，其中，在car的细胞加工和定位至细胞膜的过程中，该前导序列可选地从抗原结合结构域(例如scfv)切割下来。在各种实施方式中，car是重组多肽，其包含抗原结合结构域、铰链区(hr)、跨膜结构域(tmd)、可选的共刺激结构域(csd)和胞内信号结构域(isd)。第一代car构建体中通常没有可选的共刺激结构域。包含抗原结合结构域(例如vl和vh片段、vhh、配体和受体等)的第二代car通常包含共刺激结构域(例如41bb)。如本文所用，除非另有说明，术语“car”(单数或复数)还包括赋予细胞抗原特异性的新途径，例如抗体-tcr嵌合分子或ab-tcr(wo2017/070608a1，通过引用并入本文)、tcr受体融合蛋白或tfp(wo2016/187349a1，通过引用并入本文)、三功能t细胞抗原偶联物(tri-tac或tac)(参见wo2015/117229a1，通过引用并入本文)。通常，使用术语“car-t细胞”指代经过工程化改造以表达嵌合抗原受体的t细胞。因此，携带此类car的t淋巴细胞通常被称为car-t淋巴细胞。car也可以在t细胞之外的细胞中表达，例如造血干细胞、诱导多能干细胞(ipsc)、nk细胞和巨噬细胞。[0054]“密码子优化”或“控制物种密码子偏倚”是指使用特定宿主细胞的偏爱密码子。如本领域技术人员将理解的，修饰编码序列以增强其在特定宿主中的表达可以是有利的。遗传密码是冗余的，具有64个可能的密码子，但通常大多数生物体仅使用这些密码子的子集。一个物种中最常使用的密码子被称为最佳密码子，那些不经常使用的密码子被归类为稀有密码子或低使用密码子。作为密码子优化的一部分，可以修饰本公开载体的编码序列以限制apobec介导的突变。在一个实施方式中，可以工程化改造本公开载体以改变它们的稳定性和/或表达。例如，当载体在细胞中复制时，可能因载体中失活或减毒突变积累的频率而发生表达的变化。研究表明，频率最高的事件之一是g到a的突变(对应于c到t的突变)，其特点是apobec介导的来自首个复制步骤的单链dna负链中的突变。这可能导致载体编码的蛋白质的氨基酸组成的变化，以及从tgg(色氨酸)到终止密码子(tag或tga)的破坏性变化。在一个实施方式中，这种失活变化通过在apobec修饰位置的其他具有相似化学或结构特性的氨基酸(如苯丙氨酸或酪氨酸)的密码子替换来避免。[0055]此类突变可以包括载体结构域的编码序列中的一个以上密码子的修饰，将色氨酸密码子改变为维持编码蛋白的生物活性的允许密码子。本领域已知色氨酸的密码子是ugg(dna中为tgg)。此外，本领域已知“终止密码子”是uaa、uag或uga(dna中为taa、tag或tga)。色氨酸密码子中的单点突变可以产生非天然终止密码子(例如，ugg-》uag或ugg-》uga)。还已知人apobec3gf(ha3g/f)通过g-》a超突变抑制逆转录病毒的复制(neogi等，j.int.aids soc.，16(1):18472，2013年2月15日)。因此，本公开包括对本公开载体的编码序列的修饰，通过将色氨酸密码子修饰为允许的非色氨酸密码子来减少apobec超突变。[0056]“保守取代”或“保守序列修饰”是指不显著影响或改变编码蛋白的结合特性或功能的氨基酸修饰。例如，“保守序列修饰”是指不显著影响或改变本公开的car构建体的结合特性或功能的氨基酸修饰(例如，恒定链、抗体、抗体片段或非免疫球蛋白结合结构域中的保守改变)。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术引入修饰，例如定点诱变和pcr介导的诱变。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本公开的car中的一个以上氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的结合和/或功能测定法来测试改变的car。[0057]如本文所用，“共刺激结构域”是指增强t细胞的增殖、存活和/或发育的生物剂。例如，共刺激结构域可以包含如下中的任意一种以上的共刺激结构域：tnfr超家族成员、cd28、cd137(4-1bb)、cd134(ox40)、dap10、cd27、cd2、cd5、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、lck、tnfr-i、tnfr-ii、fas、cd30、cd40或它们的组合。其他共刺激结构域(例如来自其他蛋白质)对于本领域技术人员将是显而易见的，并且可以与本公开的替代实施方式结合使用。[0058]细胞因子释放综合征(crs)是细胞疗法(例如，car-t、双特异性t细胞衔接抗体等)的并发症，其表现为发热、低血压、呼吸急促、肾功能障碍、肺功能障碍和/或毛细血管渗漏综合征等体征和症状。crs通常是由于细胞因子(例如il6和il1)的过量产生。[0059]如本文所用，术语“衍生自”表示第一和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并且不包括对衍生自第二分子的第一分子的工艺或来源的限制。例如，在衍生自抗体分子的抗原结合结构域的情况下，抗原结合结构域保留了足够的抗体结构以使其具有所需的功能，即与抗原结合的能力。它不包括对产生抗体的特定工艺的任何限制。[0060]“结构域”或“模块”是指较大构建体的离散区段或部分，其可以被类似的结构域替换而不影响构建体的其他结构域或模块的功能。例如，在嵌合抗原受体中，多肽或编码核酸序列可以被描述为具有结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。可以修改或改变car的每个“结构域”而不影响car的其他结构域。例如，结合结构域可以是本文所述的许多不同结合结构域中的一个。结合结构域可以是与cd19抗原结合的多肽序列。此cd19结合结构域可以用与cd20结合的结合结构域替换而不影响或不必改变跨膜结构域。类似地，包含在病毒衣壳中的本公开的逆转录病毒载体包含具有多个结构域的多核苷酸有义rna链，其包括(从5'到3')：5'重复(5'r)-u5-包装序列-car序列-(可选的杀伤开关，包含与例如胸苷激酶编码序列连接的ires结构域)-mirna靶向序列-u3-3'重复(3'r)。可以改变病毒多核苷酸的每个结构域/模块，从而可以提供不同car序列、不同杀伤开关(例如tko或cd)、不同mirna靶向序列等。本公开的构建体在设计上是模块化的。构建体(无论是多核苷酸构建体还是编码的多肽构建体)的每个结构域/模块都可以在序列中包含微小的变化，只要这些变化不破坏该结构域的生物活性。因此，例如，跨膜结构域可以与特定跨膜序列具有80％-100％的同一性。[0061]如本文所用，“基因修饰的细胞”、“重定向细胞”、“基因工程细胞”或“修饰的细胞”指表达例如car的细胞。在一些实施方式中，基因修饰的细胞包含编码car的载体。[0062]如本文所用，“铰链区”(hr)是指在car的抗原结合结构域和跨膜结构域之间的亲水区。铰链区包括但不限于抗体或抗体的片段或衍生物的fc片段、抗体或抗体的片段或衍生物的铰链区、抗体的ch2区、抗体的ch3区、人工间隔子序列或它们的组合。铰链区的示例包括但不限于cd8a铰链和由多肽制成的人工间隔子，其可以小至例如igg(例如人igg4)的gly3或ch1和ch3结构域。在一些实施方式中，铰链区是如下中的任意一种以上：(i)igg4的铰链区、ch2区和ch3区，(ii)igg4的铰链区，(iii)igg4的铰链和ch2，(iv)cd8a的铰链区，(v)igg1的铰链区、ch2区和ch3区，(vi)igg1的铰链区，或(vi)igg1的铰链区和ch2区。其他铰链区对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且可以与本公开的替代性实施方式结合使用。[0063]如本文所用，“免疫细胞”是指哺乳动物免疫系统的细胞，包括但不限于抗原呈递细胞、b细胞、嗜碱性粒细胞、细胞毒性t细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、粒细胞、辅助t细胞、白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、记忆细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、吞噬细胞、浆细胞和t细胞。“体内免疫细胞”是指存在于受试者体内并且尚未从受试者中分离或移除的免疫细胞。[0064]如本文所用，术语“免疫效应细胞”是指参与免疫反应(例如促进免疫效应反应)的细胞。免疫效应细胞的示例包括t细胞(例如α/βt细胞和γ/δt细胞)、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、肥大细胞和骨髓来源的吞噬细胞。[0065]“胞内信号结构域”(isd)或“胞质结构域”是指分子的胞内信号部分。胞内信号结构域产生促进细胞免疫效应功能的信号。免疫效应功能的示例包括细胞溶解活性和辅助活性(包括细胞因子的分泌)。转导效应功能信号的结构域的示例包括但不限于t细胞受体复合物的z链或它的任何同源物(例如h链、fcer1g和b链、mb1(iga)链、b29(igb)链等)、人cd3ζ链、cd3多肽(d、d和e)、syk家族酪氨酸激酶(syk、zap 70等)、src家族酪氨酸激酶(lck、fyn、lyn等)，以及其他参与t细胞转导的分子(例如cd2、cd5和cd28)。其他胞内信号结构域对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且可以与本公开的替代性实施方式结合使用。[0066]在另一个实施方式中，胞内信号结构域可以包含初级胞内信号结构域。示例性的初级胞内信号结构域包括衍生自负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在另一个实施方式中，胞内信号结构域可以包含共刺激胞内结构域。示例性共刺激胞内信号结构域包括衍生自负责共刺激信号或非抗原依赖性刺激的分子的那些。例如，初级胞内信号结构域可以包含cd3z或cd3z1xx的胞质序列(feucht等，nd 2019)，共刺激胞内信号结构域可以包含来自共受体分子或共刺激分子(例如cd28或41bb)的胞质序列。[0067]初级胞内信号结构域可以包含称为免疫受体酪氨酸活化基序或itam的信号基序。包含初级胞质信号序列的itam的示例包括但不限于衍生自cd3ζ、共用ferγ(fcer1g)、feγriia、ferβ(feεr1b)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dap10和dap12的那些。[0068]如本文所用，术语“分离的”是指基本上不含其他材料的分子或生物制品或细胞材料。在一个实施方式中，术语“分离的”是指分别从天然来源中存在的其他dna或rna、或蛋白质或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官中分离的核酸(例如dna或rna)、蛋白质或多肽、细胞或细胞器、或组织。术语“分离的”还指当通过重组dna技术产生时基本上不含细胞物质、病毒物质或培养基的核酸或肽，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质的核酸或肽。此外，“分离的核酸”意在包括不作为片段天然存在并且不会在天然状态下发现的核酸片段。在本文中，术语“分离的”还用于指从其他细胞蛋白中分离的多肽，并且意在包括纯化的和重组的多肽。在本文中，术语“分离的”还用于指从其他细胞或组织中分离的细胞或组织，并且意在包括培养的和工程化改造的细胞或组织。[0069]如本文所用，术语“连接子”(也称为“连接子结构域”或“连接区”)分别是指将car多核苷酸或多肽的两个以上结构域或区连接在一起的寡核苷酸或肽。在任何地方的连接子的长度可以是1至500个氨基酸或3至1500个核苷酸。在一些实施方式中，“连接子”是可切割的或不可切割的。除非另有说明，否则本文使用的术语“连接子”是指不可切割的连接子。所述不可切割的连接子可以由允许相邻蛋白质结构域相对于彼此自由移动的柔性氨基酸残基组成。此类残基的非限制性示例包括甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方式中，连接子包括非柔性氨基酸残基。可切割连接子的示例包括2a连接子(例如t2a)、2a样连接子或其功能等效物以及它们的组合。在一些实施方式中，连接子包括细小核糖核酸病毒2a样连接子、猪捷申病毒的chysel序列(p2a)、明脉扁刺蛾病毒病毒的chysel序列(t2a)或它们的组合、变体和功能等效物(例如gsg修饰的变体)。在一些实施方式中，连接子序列可以包含导致在2a甘氨酸和2b脯氨酸之间进行切割的基序。本领域技术人员容易理解其他可用于本文的可切割的连接子。[0070]如本文所用，术语“柔性多肽连接子”是指由单独或组合使用的以将多肽链连接在一起(例如将重链可变区和轻链可变区连接在一起)的氨基酸(例如甘氨酸和/或丝氨酸)残基组成的肽连接子。在一个实施方式中，柔性多肽连接子是gly/ser连接子并且包含氨基酸序列(gly3-ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10等)。[0071]如本文所用，“哺乳动物”是指哺乳动物纲的任何成员，包括但不限于：人和非人灵长类动物，例如黑猩猩和其他猿类和猴类；农场动物，例如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物，包括例如小鼠、大鼠和豚鼠等啮齿动物。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成人和新生儿受试者以及胎儿(无论是男性或女性)都旨在被包括于该术语范围内。本领域技术人员将认识到，对car构建体和相关序列进行优化以用于特定哺乳动物物种(例如，编码的蛋白质/多肽衍生自被治疗的哺乳动物物种)。[0072]如本文所用，“脱靶转导细胞”是指如下细胞：所述细胞被本公开的病毒载体感染，但载体基因在其中的表达是不需要的或不期望的。本领域将认识到，可以通过在病毒包膜上加入靶向蛋白来使病毒载体成为“靶向的”。此外或可替代地，可以通过使用组织特异性的启动子来控制病毒基因的表达。在其他的或进一步的实施方式中，可以通过使用存在的用于控制先天基因表达控制的细胞机制来控制病毒基因/构建体的表达。在这种情况下，可以使用rnai靶序列，从而可以使用先天mirna与靶序列的结合来控制脱靶细胞类型中的表达。[0073]术语“可操作地连接”或“功能性地连接”是指第一组分和第二组分之间的功能性连接或缔合，使得每个组分可以是功能性的。例如，可操作地连接包括调节序列和异源核酸序列之间的缔合，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系时，该第一核酸序列与该第二核酸序列可操作地连接。在两个多肽可操作地连接的情况下，第一多肽以不依赖于任何连接的方式发挥功能，第二多肽如两者之间不存在连接一样地发挥功能。[0074]在两个以上核酸或多肽序列的情况下，“同一性百分比”是指通过序列同一性百分比相关联的两个以上序列。当在比较窗口或指定区域进行比较和比对以获得最大对应性时，如果两个序列具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基(例如在指定区域或在整个序列上(当未指定时)60％的同一性，可选地，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性)，则两个序列是“基本上同一的”，如使用以下序列比较算法中的一种或通过手动比对和目视检查测量的。可选地，同一性存在于长度至少为约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域，或更典型地存在于长度至少为100至500或1000以上核苷酸(或20、50、200以上氨基酸)的区域。[0075]对于序列比较，通常将一个序列作为参考序列，将测试序列与该参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定替代参数。然后，序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的并且可公开获得。例如可以通过“smith和waterman，(1970)adv.appl.math.2:482c”的局部同源算法，通过“needleman和wunsch，(1970)j.mol.bioi.48:443”的同源比对算法，通过“pearson和lipman，(1988)proc.nat'l.acad.sci.usa 85:2444”的相似性检索方法，通过这些算法的计算机化执行(wisconsin genetics software package中的gap、bestfit、fasta和tfasta，genetics computer group,575 science dr.,madison,wi)，或通过手动比对和目视检查(参见例如brent等，(2003)current protocols in molecular biology)进行用于比较的最佳序列比对。[0076]可以用于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的两个示例是blast算法和blast 2.0算法，它们分别在“altschul等，(1977)nuc.acids res.25:3389-3402”和“altschul等，(1990)j.mol.bioi.215:403-410”中有所描述。用于执行blast分析的软件通过国家生物技术信息中心(ncbi)可公开获得。[0077]还可以使用“e.meyers和w.miller,(1988)comput.appl.biosci.4:11-17”的算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已被并入align程序(2.0版)中，使用pam120权重残基表，空位长度罚分为12和空位罚分为4。此外，可以使用“needleman和wunsch(1970)j.mol.bioi.48:444-453”算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已被并入gcg软件包中的gap程序(可在www.gcg.com获得)中，使用blossom 62矩阵或pam250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。[0078]如本文所用，术语“rnai靶序列”或“mir靶序列”或“mir靶盒”涉及与诱导rna干扰的dsrna(干扰rna)特异性杂交的核酸序列。因此，rnai靶序列是与至少一种rnai诱导分子(干扰rna)基本上互补的序列。rnai靶序列是mirna靶序列或sirna靶序列。通常，rnai靶序列是mirna靶序列。如下文更全面地描述，本公开提供了多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体包含car的编码序列、一种以上rnai靶向序列和可选的杀伤开关编码序列。[0079]术语“单链可变区”或“scfv”是指如下融合蛋白，该融合蛋白包含：包含轻链可变区的至少一个抗体片段，以及包含重链可变区的至少一个抗体片段；其中，轻链可变区和重链可变区连续连接(例如通过合成连接子，例如短的柔性多肽连接子)且能够表达为单链多肽，并且scfv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用，scfv可以具有任意顺序(例如针对多肽的n末端和c末端)的vl和vh可变区，scfv可以包含vl-连接子-vh或者可以包含vh-连接子-vl。或者，scfv也被描述为(vl+vh)或(vh+vl)。[0080]术语“信号结构域”是指蛋白质的功能区域，其通过产生第二信使或通过响应此类信使而作为效应物发挥作用通过确定的信号通路在细胞内传递信息以调节细胞活性。[0081]术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫反应的活的生物体(例如，任何驯化的哺乳动物或人)。术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”在本文中可互换使用，是指任何需要施用本公开的组合物或药物组合物的受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等，优选为人。[0082]术语“t细胞”和“t淋巴细胞”在本文中可互换使用以及同义使用。示例包括但不限于幼稚t细胞(“淋巴细胞祖细胞”)、中枢记忆t细胞、效应记忆t细胞、t记忆干细胞(tscm)、ipsc衍生的t细胞、合成t细胞或它们的组合。[0083]术语“治疗作用”是指可以通过多种方式表现的生物学效应，包括但不限于例如减小肿瘤体积、减少癌细胞数量、减少转移灶数量、增加预期寿命、降低癌细胞增殖、降低癌细胞存活、降低感染原滴度、减少感染原集落计数、改善与疾病状况相关的多种生理症状。“治疗作用”还可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防疾病发生或预防疾病复发的能力来表现。[0084]如本文所用，术语“治疗有效量”是指减少疾病或病症的至少一种以上症状的包含载体或体内基因工程细胞的药物组合物的量，并且涉及足够量的药物组合物以提供所需的效果。如本文所用，短语“治疗有效量”是指以适用于任何医学治疗的合理益处/风险比治疗疾病的药物组合物的足够的量。[0085]治疗性的或预防性的症状的显著减轻是与对照或未治疗的受试者或在施用本文所述的载体之前的受试者状态相比，测量参数的例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％或以上。测量或可测量的参数包括临床上可检测的疾病标志物，例如生物标志物的升高或降低水平，以及与临床上可接受的癌症的症状或标志物的量表相关的参数。然而，应当理解，本文公开的组合物和制剂的总每日使用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。所需的确切的量将根据所治疗疾病的类型、受试者的性别、年龄和体重等因素而有所变化。[0086]如本文所用，“跨膜结构域”(tmd)是指car的穿过细胞膜的区域。本公开的car的跨膜结构域是跨膜蛋白(例如i型跨膜蛋白)的跨膜区、人工疏水序列或它们的组合。其他跨膜结构域对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且可以与本公开的替代性实施方式结合使用。在一些实施方式中，tmd选自如下成员的跨膜结构域：t细胞受体的α链、β链或ζ链、cd3γ、cd3ε、cd3δ、cd28、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、kirds2、ox40、cd2、cd27、lfa-1(cdlla，cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd40、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrfl)、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7ra、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cdlld、itgae、cd103、itgal、cdlla、lfa-1、itgam、cdllb、itgax、cdllc、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、dnam1(cd226)、slamf4(cd244，2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、slamf6(ntb-a，lyl08)、slam(slamf1，cd150，ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d和/或nkg2c。[0087]如本文所用，“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指可以将多核苷酸序列(例如外源基因)引入宿主细胞从而转化宿主并促进引入序列的表达(例如引入序列的转录和翻译)的载体。载体包括质粒、噬菌体、病毒等。[0088]术语“病毒载体”是指从病毒获得或衍生的载体。通常，病毒是逆转录病毒，包括但不限于慢病毒和γ逆转录病毒。本公开的病毒载体可以是逆转录病毒载体，例如γ-逆转录病毒载体。病毒载体可以是基于人类免疫缺陷病毒的病毒载体。本公开的病毒载体可以是慢病毒载体。载体可以是基于非灵长类慢病毒的载体，例如马感染性贫血病毒(eiav)。本公开的病毒载体在病毒包膜中包含促有丝分裂的t细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的t细胞活化跨膜蛋白。如上所述，促有丝分裂的t细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的t细胞活化跨膜蛋白衍生自宿主细胞膜。[0089]如本文所用，“病毒样颗粒”或“vlp”是指缺乏病毒基因组的病毒颗粒。在某些情况下，vlp缺少env蛋白。与完整的病毒颗粒一样，它们含有由宿主细胞脂质双层(膜)制成的外部病毒包膜，因此含有宿主细胞跨膜蛋白。vlp可用在本公开的方法和组合物中。[0090]如下文更全面地描述，本公开提供了一种重组病毒载体，其包含插入到载体中的一个以上mirna靶序列的多个拷贝，以控制载体中包含的编码序列(例如car编码序列)在脱靶转导细胞中的表达。在某些实施方式中，重组病毒载体可以包含插入到壳体包裹的病毒多核苷酸中的mirna靶序列。在脱靶细胞中表达的mirna可以与此类mirna靶序列结合并抑制含有mirna靶序列的病毒多核苷酸的表达，从而限制病毒复制和/或载体包含的编码序列(例如car)在脱靶转导细胞中的表达。此类重组病毒载体在本文中可被称为“mir减毒的”、“表达限制的载体”或“复制限制的载体”，因为与不表达mir或mir表达降低的细胞相比，它们在表达能够与加入的mir靶序列结合的一种以上mirna的细胞中表现出降低的或减弱的载体包含的编码序列的复制和/或表达。[0091]在某些实施方式中，将一种以上mirna靶序列加入3'非翻译区(utr)和/或car编码序列下游的3'utr中。当转录时，car编码序列的mrna转录物包含mir-靶序列(ts)，其包含一个以上mirna靶序列(例如mirna靶序列盒)。在一些实施方式中，本文所述的mir-ts盒包含至少一个mirna靶序列。在一些实施方式中，本文所述的mir-ts盒包含多个mirna靶序列。例如，在一些实施方式中，本文所述的mir-ts盒包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个以上mirna靶序列。在此类实施方式中，其中mir-ts盒包含两个以上mirna靶序列，该两个以上靶序列可以相同或不同。[0092]在一些实施方式中，mir-ts盒包含多个mirna靶序列，其中多个mirna靶序列中的每个mirna靶序列是相同mirna的靶序列。例如，mir-ts盒可以包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个以上拷贝的相同mir靶序列，这些mir靶序列直接邻接或被核苷酸间隔子(例如1-10核苷酸)隔开。在一些实施方式中，mir-ts盒包含2至6个拷贝的相同mir靶序列。在一些实施方式中，mir-ts盒包含3个拷贝的相同mir靶序列。在一些实施方式中，mir-ts盒包含4个拷贝的相同mir靶序列。在一些实施方式中，mir-ts盒包含5个拷贝的相同mir靶序列。在一些实施方式中，mir-ts盒包含6个拷贝的相同mir靶序列。在一些实施方式中，mir-ts盒包含7个拷贝的相同mir靶序列。在一些实施方式中，mir-ts盒包含8个拷贝的相同mir靶序列。在一些实施方式中，mir-ts盒包含9个拷贝的相同mir靶序列。在一些实施方式中，mir-ts盒包含10个拷贝的相同mir靶序列。[0093]在一些实施方式中，本文所述的mir-ts盒包含多个mirna靶序列，其中，所述多个mirna靶序列包含至少两种不同mirna靶序列。在一些实施方式中，本文所述的mir-ts盒包含2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种不同mirna靶序列。例如，在一些实施方式中，mir-ts盒可以包含一个以上拷贝的第一mirna靶序列和一个以上拷贝的第二mirna靶序列。在一些实施方式中，mir-ts盒包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个以上拷贝的第一mir靶序列和至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个以上拷贝的第二mir靶序列。在一些实施方式中，mir-ts盒包含3个或4个拷贝的第一mir靶序列和3个或4个拷贝的第二mir靶序列。在一些实施方式中，多个mirna靶序列包含至少3种不同mirna靶序列。例如，在一些实施方式中，mir-ts盒包含一个以上拷贝的第一mir靶序列、一个以上拷贝的第二mir靶序列和一个以上拷贝的第三mir靶序列。在一些实施方式中，mir-ts盒包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个以上拷贝的第一mir靶序列，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个以上拷贝的第二mir靶序列，以及至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个以上拷贝的第三mir靶序列。在一些实施方式中，mir-ts盒包含3个或4个拷贝的第一mir靶序列、3个或4个拷贝的第二mir靶序列和3个或4个拷贝的第三mir靶序列。在一些实施方式中，多个mirna靶序列包含至少4种不同mirna靶序列。例如，在一些实施方式中，mir-ts盒包含一个以上拷贝的第一mir靶序列、一个以上拷贝的第二mir靶序列、一个以上拷贝的第三mir靶序列和一个以上拷贝的第四mir靶序列。在一些实施方式中，mir-ts盒包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个以上拷贝的第一mir靶序列，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个以上拷贝的第二mir靶序列，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个以上拷贝的第三mir靶序列，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个以上拷贝的第四mir靶序列。在一些实施方式中，mir-ts盒包含3个或4个拷贝的第一mir靶序列、3个或4个拷贝的第二mir靶序列、3个或4个拷贝的第三mir靶序列和3个或4个拷贝的第四个mir靶序列。[0094]在一些实施方式中，其中mir-ts盒包含多个mirna靶序列，多个mirna靶序列可以串联排列，没有任何插入的核酸序列。在一些方面，多个mirna靶序列可以通过连接子序列隔开。在一些实施方式中，连接子序列包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个以上核苷酸。在一些实施方式中，连接子序列包含约4个至约20个核苷酸。在进一步的实施方式中，连接子序列包含约4个至约16个核苷酸。作为一个说明性实施方式，mir-ts盒可以包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个以上的如下亚基：第一mirna靶序列-连接子-第二mirna靶序列，其中相邻的亚基被附加的连接子序列隔开。在一些实施方式中，第一mirna靶序列和第二mirna靶序列是相同mirna的靶标。在一些实施方式中，第一mirna靶序列和第二mirna靶序列是不同mirna的靶标。[0095]在一些实施方式中，mir靶序列是mir-1251-5p、mir-219a-5p、mir-219a-2-3p、mir-124-3p、mir-448、mir-138-2-3p、mir-490-5p、mir-129-1-3p、mir-1264、mir-3943、mir-490-3p、mir-383-5p、mir-133b、mir-129-2-3p、mir-128-2-5p、mir-133a-3p、mir-129-5p、mir-1-3p、mir-885-3p、mir-124-5p、mir-759、mir-7158-3p、mir-770-5p、mir-135a-5p、mir-885-5p、let-7g-5p、mir-100、mir-101、mir-106a、mir-124、mir-124a、mir-125a、mir-125a-5p、mir-125b、mir-127-3p、mir-128、mir-129、mir-136、mir-137、mir-139-5p、mir-142-3p、mir-143、mir-145、mir-146b-5p、mir-149、mir-152、mir-153、mir-195、mir-21、mir-212-3p、mir-219-5p、mir-222、mir-29b、mir-31、mir-3189-3p、mir-320、mir-320a、mir-326、mir-330、mir-331-3p、mir-340、mir-342、mir-34a、mir-376a、mir-449a、mir-483-5p、mir-503、mir-577、mir-663、mir-7、mir-7-5p、mir-873、let-7a、let-7f、mir-107、mir-122、mir-124-5p、mir-139、mir-146a、mir-146b、mir-15b、mir-16、mir-181a、mir-181a-1、mir-181a-2、mir-181b、mir-181b-1、mir-181b-2、mir-181c、mir-181d、mir-184、mir-185、mir-199a-3p、mir-200a、mir-200b、mir-203、mir-204、mir-205、mir-218、mir-23b、mir-26b、mir-27a、mir-29c、mir-328、mir-34c-3p、mir-34c-5p、mir-375、mir-383、mir-451、mir-452、mir-495、mir-584、mir-622、mir-656、mir-98、mir-124-3p、mir-181b-5p、mir-200b和/或mir-3189-3p的靶序列。在一个进一步的实施方式中，载体包含用于治疗脑癌的car编码序列。[0096]在一些实施方式中，mir靶序列是mir-10b-5p、mir-126-3p、mir-145-3p、mir-451a、mir-199b-5p、mir-5683、mir-3195、mir-3182、mir-1271-5p、mir-204-5p、mir-409-5p、mir-136-5p、mir-514a-5p、mir-559、mir-483-3p、mir-1-3p、mir-6080、mir-144-3p、mir-10b-3p、mir-6130、mir-6089、mir-203b-5p、mir-4266、mir-4327、mir-5694、mir-193b、let-7a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、mir-100、mir-107、mir-10a、mir-10b、mir-122、mir-124、mir-1258、mir-125a-5p、mir-125b、mir-126、mir-127、mir-129、mir-130a、mir-132、mir-133a、mir-143、mir-145、mir-146a、mir-146b、mir-147、mir-148a、mir-149、mir-152、mir-153、mir-15a、mir-16、mir-17-5p、mir-181a、mir-1826、mir-183、mir-185、mir-191、mir-193a-3p、mir-195、mir-199b-5p、mir-19a-3p、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-205、mir-206、mir-211、mir-216b、mir-218、mir-22、mir-26a、mir-26b、mir-300、mir-30a、mir-31、mir-335、mir-339-5p、mir-33b、mir-34a、mir-34b、mir-34c、mir-374a、mir-379、mir-381、mir-383、mir-425、mir-429、mir-450b-3p、mir-494、mir-495、mir-497、mir-502-5p、mir-517a、mir-574-3p、mir-638、mir-7、mir-720、mir-873、mir-874、mir-92a、mir-98、mir-99a、mmu-mir-290-3p和/或mmu-mir-290-5p的靶序列。在一个进一步的实施方式中，载体包含用于治疗乳腺癌的car编码序列。[0097]在一些实施方式中，mir靶序列是mir-143、mir-145、mir-17-5p、mir-203、mir-214、mir-218、mir-335、mir-342-3p、mir-372、mir-424、mir-491-5p、mir-497、mir-7、mir-99a、mir-99b、mir-100、mir-101、mir-15a、mir-16、mir-34a、mir-886-5p、mir-106a、mir-124、mir-148a、mir-29a和/或mir-375的靶序列。在一个进一步的实施方式中，载体包含用于治疗宫颈癌的car编码序列。[0098]在一些实施方式中，mir靶序列是mir-133a-5p、mir-490-5p、mir-124-3p、mir-137、mir-655-3p、mir-376c-3p、mir-369-5p、mir-490-3p、mir-432-5p、mir-487b-3p、mir-342-3p、mir-223-3p、mir-136-3p、mir-136-3p、mir-143-5p、mir-1-3p、mir-214-3p、mir-143-3p、mir-199a-3p、mir-199b-3p、mir-451a、mir-127-3p、mir-133a-3p、mir-145-5p、mir-145-3p、mir-199a-5p、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、mir-100、mir-101、mir-126、mir-142-3p、mir-143、mir-145、mir-192、mir-200c、mir-21、mir-214、mir-215、mir-22、mir-25、mir-302a、mir-320、mir-320a、mir-34a、mir-34c、mir-365、mir-373、mir-424、mir-429、mir-455、mir-484、mir-502、mir-503、mir-93、mir-98、mir-186、mir-30a-5p、mir-627、let-7a、mir-1、153、mir-155、mir-199a、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-212、mir-335、mir-34a、mir-34b、mir-34c、mir-409-3p、mir-411、mir-429、mir-432、mir-449a、mir-494、mir-497、mir-498、mir-519d、mir-655、mir-9、mir-98、mir-101、mir-532-5p、mir-124a、mir-192、mir-193a和/或mir-7的靶序列。在一个进一步的实施方式中，载体包含用于治疗卵巢癌的car编码序列。[0107]在一些实施方式中，mir靶序列是插入病毒复制所需的一种以上病毒基因的5'utr或3'utr的mir-216a-5p、mir-802、mir-217、mir-145-3p、mir-143-3p、mir-451a、mir-375、mir-214-3p、mir-216b-3p、mir-432-5p、mir-216a-3p、mir-199b-5p、mir-199a-5p、mir-136-3p、mir-216b-5p、mir-136-5p、mir-145-5p、mir-127-3p、mir-199a-3p、mir-199b-3p、mir-559、mir-129-2-3p、mir-4507、mir-1-3p、mir-148a-3p、mir-101、mir-1181、mir-124、mir-1247、mir-133a、mir-141、mir-145、mir-146a、mir-148a、mir-148b、mir-150*、mir-150-5p、mir-152、mir-15a、mir-198、mir-203、mir-214、mir-216a、mir-29c、mir-335、mir-34a、mir-34b、mir-34c、mir-373、mir-375、mir-410、mir-497、mir-615-5p、mir-630、mir-96、mir-132、let-7a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、mir-126、mir-135a、mir-143、mir-144、mir-150、mir-16、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-217、mir-218、mir-337、mir-494和/或mir-98的靶序列。在一个进一步的实施方式中，载体包含用于治疗胰腺癌的car编码序列。[0108]在一些实施方式中，mir靶序列是let-7a-3p、let-7c、mir-100、mir-101、mir-105、mir-124、mir-128、mir-1296、mir-130b、mir-133a-1、mir-133a-2、mir-133b、mir-135a、mir-143、mir-145、mir-146a、mir-154、mir-15a、mir-187、mir-188-5p、mir-199b、mir-200b、mir-203、mir-205、mir-212、mir-218、mir-221、mir-224、mir-23a、mir-23b、mir-25、mir-26a、mir-26b、mir-29b、mir-302a、mir-30a、mir-30b、mir-30c-1、mir-30c-2、mir-30d、mir-30e、mir-31、mir-330、mir-331-3p、mir-34a、mir-34b、mir-34c、mir-374b、mir-449a、mir-4723-5p、mir-497、mir-628-5p、mir-642a-5p、mir-765和/或mir-940的靶序列。在一个进一步的实施方式中，载体包含用于治疗前列腺癌的car编码序列。[0109]在一些实施方式中，mir靶序列是mir-101、mir-183、mir-204、mir-34a、mir-365b-3p、mir-486-3p和/或mir-532-5p的靶序列。在一个进一步的实施方式中，载体包含用于治疗视网膜母细胞瘤的car编码序列。[0110]在一些实施方式中，mir靶序列是mir-143-3p、mir-133b、mir-1264、mir-448、mir-1298-5p、mir-490-5p、mir-138-2-3p、mir-144-3p、mir-144-5p、mir-150-5p、mir-129-1-3p、mir-559、mir-1-3-p、mir-143-5p、mir-223-3p、mir-3943、mir-338-3p、mir-124-3p、mir-219a-5p、mir-219a-2-3p、mir-451a、mir-142-5p、mir-133a-3p、mir-145-5p和/或mir-145-3p的靶序列。在一个进一步的实施方式中，载体包含用于治疗胶质母细胞瘤的car编码序列。[0111]在一些实施方式中，mir靶序列是mir-143-3p、mir-223-3p、mir-6080、mir-208b-3p、mir-206、mir-133a-5p、mir-133b、mir-199a-5p、mir-199b-5p、mir-145-3p、mir-145-5p、mir-150-5p、mir-142-3p、mir-144-3p、mir-144-5p、mir-338-3p、mir-214-3p、mir-559、mir-133a-3p、mir-1-3p、mir-126-3p、mir-142-5p、mir-451a、mir-199a-3p和/或mir-199b-3p的靶序列。在一个进一步的实施方式中，载体包含用于治疗头颈癌的car编码序列。[0112]取决于设计的car和工程化改造到car中或car上的结合结构域，这些方法和组合物可用于治疗多种疾病和病症。例如，靶向表1中列出的任意数量的“靶标”的结合结构域可用于治疗与靶标相关的疾病：[0113]表1：[0114]本公开提供了向有需要的受试者提供过继性细胞免疫的方法，其包括向受试者施用编码嵌合抗原受体(car)的本公开载体，使得car在期望的免疫细胞类型或免疫细胞干细胞(例如造血干细胞)中选择性表达。该方法包括施用包含病毒衣壳和包膜的病毒构建体，所述病毒构建体包含衍生自病毒基因组的多核苷酸。在一个实施方式中，多核苷酸包含rna。在另一个实施方式中，多核苷酸衍生自γ逆转录病毒。在又一个实施方式中，多核苷酸在5'端和3'端包含长末端重复。在又一个实施方式中，多核苷酸包含car的编码序列。在又一个实施方式中，多核苷酸包含一个以上mirna靶序列。在又一个实施方式中，mirna靶序列是存在于脱靶细胞中的mirna的靶标。在又一个实施方式中，多核苷酸包含编码多肽的序列，所述多肽将前药转化为毒性药物。[0115]本公开提供了一种质粒，其包含产生多核苷酸的序列，所述多核苷酸被包封在病毒衣壳中。在一个实施方式中，多核苷酸包含rna。在另一个实施方式中，多核苷酸衍生自γ逆转录病毒。在又一个实施方式中，多核苷酸在5'端和3'端包含长末端重复。在又一个实施方式中，多核苷酸包含car的编码序列。在又一个实施方式中，多核苷酸包含一个以上mirna靶序列。在又一个实施方式中，mirna靶序列是存在于脱靶细胞中(但不在靶细胞中，也不在用于制备感染性载体的细胞中)的mirna的靶标。在又一个实施方式中，多核苷酸包含编码多肽的序列，所述多肽将前药转化为毒性药物。[0116]本公开提供了一种病毒多核苷酸构建体，其从5'端到3'端包含：来自γ逆转录病毒的“r-u5”结构域，该“r-u5”结构域可操作地连接到结合结构域编码序列，该结合结构域编码序列可操作地连接到铰链/连接子编码序列，该铰链/连接子编码序列可操作地连接到跨膜结构域编码序列，该跨膜结构域编码序列可操作地连接到信号结构域编码序列；之后是一个以上mirna靶序列(mir-ts；mir靶盒)；之后是来自γ逆转录病毒的“u3-r”结构域。在一些实施方式中，病毒rna可以包括与ires可操作地连接的杀伤开关的编码序列。在一些实施方式中，ires-杀伤开关可以在mirna盒的上游或下游(5'端或3'端)。多核苷酸序列可以示意性地表示为(也参见图1)：r-u5-结合结构域-铰链/连接子-tm结构域-信号结构域-mirna靶标-u3-r[0117]在一个实施方式中，r-u5结构域可以包含与以下序列具有至少80％-100％同一性的序列：gcgccaguccuccgauugacugagucgcccggguacccguguauccaauaaacccucuugcaguugcauccgacuuguggucucgcuguuccuugggagggucuccucugagugauugacuacccgucagcgggggucuuucauu(seq id no：25的核苷酸1至核苷酸145)[0118]在一个实施方式中，r-u5-包装结构域可以包含与以下序列具有至少80％-100％同一性的序列：gcgccaguccuccgauugacugagucgcccggguacccguguauccaauaaacccucuugcaguugcauccgacuuguggucucgcuguuccuugggagggucuccucugagugauugacuacccgucagcgggggucuuucauuugggggcucguccgggaucgggagaccccugcccagggaccaccgacccaccaccgggagguaagcuggccagcaacuuaucugugucuguccgauugucuagugucuaugacugauuuuaugcgccugcgucgguacuaguuagcuaacuagcucuguaucuggcggacccgugguggaacugacgaguucggaacacccggccgcaacccugggagacgucccagggacuucgggggccguuuuuguggcccgaccugaguccaaaaaucccgaucguuuuggacucuuuggugcaccccccuuagaggagggauaugugguucugguaggagacgagaaccuaaaacaguucccgccuccgucugaauuuuugcuuucgguuugggaccgaagccgcgccgcgcgucuugucugcugcagcaucguucuguguugucucugucugacuguguuucuguauuugucugagaauuaaggccagacuguuaccacucccugaaguuugaccuuaggucacuggaaagaugucgagcggaucgcucacaaccagucgguagaugucaagaagagacguuggguuaccuucugcucugcagaauggccaaccuuuaacgucggauggccgcgagacggcaccuuuaaccgagaccucaucacccagguuaagaucaaggucuuuucaccuggcccgcauggacacccagaccagguccccuacaucgugaccugggaagccuuggcuuuugaccccccucccugggucaagcccuuuguacacccuaagccuccgccuccucuuccuccauccgccccgucucucccccuugaaccuccucguucgaccccgccucgauccucccuuuauccagcccucacuccuucucuaggcgccggaauuaauucucga(seq id no：25的核苷酸1至核苷酸1055)[0119]在一个实施方式中，u3-r结构域可以包含与以下序列具有至少80％-100％同一性的序列：ugaaagaccccaccuguagguuuggcaagcuagcuuaaguaacgccauuuugcaaggcauggaaaaauacauaacugagaauagagaaguucagaucaaggucaggaacagauggaacagcugaauaugggccaaacaggauaucugugguaagcaguuccugccccggcucagggccaagaacagauggaacagcugaauaugggccaaacaggauaucugugguaagcaguuccugccccggcucagggccaagaacagaugguccccagaugcgguccagcccucagcaguuucuagagaaccaucagauguuuccagggugccccaaggaccugaaaugacccugugccuuauuugaacuaaccaaucaguucgcuucucgcuucuguucgcgcgcuucugcuccccgagcucaauaaaagagcccacaaccccucacucggcgcgccaguccuccgauugacugagucgcccggguacccguguauccaauaaacccucuugcaguugca(seq id no：25的核苷酸5537至核苷酸6051)[0120]本领域技术人员将认识到，r-u5和u3-r序列的dna质粒序列将“u”替换为“t”。[0121]“car”的结合结构域可以是编码与期望的靶抗原结合的多肽的任何序列。例如，结合结构域可以是抗体片段，例如针对期望的靶抗原的scfv(参见例如表1)。编码表1中所列靶标的各种结合结构域的序列是本领域已知的，并且在许多申请中公开。本公开的car本质上是模块化的，因此可以根据期望的靶标连接不同“结合结构域”。[0122]如上所述，可将“铰链”或连接子编码序列可操作地连接到car的结合结构域。在一些情况下，“铰链”是可选的，可将结合结构域直接连接到跨膜结构域编码序列。在另一个实施方式中，结合结构域和跨膜结构域由最小肽编码序列或间隔子隔开。各种铰链结构域和间隔子在本领域中是已知的，并且在本文中有所描述。[0123]mir靶向序列或mir盒通常包含抑制病毒构建体的多核苷酸表达的mirna分子的靶标。例如，mir靶序列通常会与不期望或不需要例如car表达的组织或细胞中表达的mirna结合，但是该mirna不在靶细胞中表达、也不在期望病毒构建体表达的载体生产细胞中表达。当尚未知晓此类序列或mirna时，可通过如下方式容易地对它们进行鉴定和表征：从不需要表达的靶组织(例如肿瘤)的几个示例和期望或需要表达的细胞(例如t细胞)的几个示例制备总rna，并对此类样品进行深度批量测序；然后使用本领域技术人员已知的生物信息技术，鉴定用于进一步测试的候选mirna和相应靶标。此外，使用本公开，本领域技术人员可以容易地鉴定用于治疗特定癌症或疾病的结合结构域，以及防止car在非期望的组织和/或细胞中表达的mirna靶向序列和合适的“铰链”、“跨膜结构域”和胞内结构域。[0124]在一些实施方式中，本公开的载体构建体将包括作为进一步安全机制的杀伤开关，使得载体构建体的表达将导致例如自杀基因(例如具有胸苷激酶(tk)或胞嘧啶脱氨酶(cd)活性的多肽)的表达。在受试者、细胞或组织已经进展为不需要载体表达的情况下，将受试者、组织或细胞与前药(例如5-氟胞嘧啶)接触，使得表达例如具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽的细胞与5-fc接触，其中，在杀伤开关的表达位点将5-fc转化为细胞毒性5-fu从而杀死载体感染的细胞。[0125]在一个实施方式中，本公开提供了一种逆转录病毒载体，其包含gag多肽、pol多肽和env多肽以及包含在逆转录病毒载体的衣壳内的逆转录病毒多核苷酸。逆转录病毒多核苷酸从5'端到3'端包含：r-u5-结合结构域-铰链/连接子-tm结构域-信号结构域-mirna靶标-u3-r。在一个实施方式中，逆转录病毒多核苷酸包含r-u5核酸序列，所述r-u5核酸序列与seq id no：25的核苷酸1至约核苷酸145(例如约核苷酸140、141、142、143、144、145、126、147、148、149或150)具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、98％、99％或100％的同一性。在一个进一步的实施方式中，逆转录病毒多核苷酸包含r-u5结构域3'端的嵌合抗原受体编码序列。在一个实施方式中，car编码序列包含抗原结合结构域(例如针对cd19的scfv)的编码序列。在一些实施方式中，结合结构域编码序列之前可以具有信号序列。在一个进一步的实施方式中，结合结构域编码序列之后具有可选的连接子/间隔子结构域序列。在一个更进一步的实施方式中，结合结构域编码序列和可选的间隔子/连接子编码序列之后具有编码跨膜结构域的核酸序列。在一个进一步的实施方式中，跨膜编码序列之后具有编码胞质信号结构域的核酸序列。在另一个实施方式中，逆转录病毒多核苷酸可以包含可选的杀伤开关结构域编码序列。可选的杀伤开关编码结构域包含ires，ires可操作地连接至多肽的编码序列，所述多肽将前药转化为细胞毒性药物。在一个实施方式中，多肽是胸苷激酶(tko)或胞嘧啶脱氨酶(cd)。在一个进一步的实施方式中，逆转录病毒多核苷酸包含至少一个、通常多个相同或不同的mirna靶向序列。mirna靶向序列位于car结构域的3'端。逆转录病毒多核苷酸还包括位于多核苷酸3'端的u3-r结构域。在一个实施方式中，u3-r结构域包含与seq id no：25的约核苷酸5537至约核苷酸6051具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、98％、99％或100％同一性的序列。在任何前述的某些实施方式中，结构域可被约2-20个核苷酸的小间隔子序列(可以是有意的或克隆的人工产物)隔开。[0126]本公开还提供了质粒序列，当所述质粒序列在合适的宿主细胞中表达时产生本公开的逆转录病毒载体。[0127]本公开提供了逆转录病毒载体，其包含重组病毒基因组，该重组病毒基因组具有r-u5结构域、包装结构域、car结构域和mirna去靶向结构域(例如mirna靶向结构域)。重组病毒基因组还可以包含杀伤开关，该杀伤开关包含自杀基因(例如产生具有tko或cd活性的多肽的基因)的编码序列。car结构域可以包含第一代、第二代或第三代car构建体(如本领域已知)，当所述car结构域在期望的免疫细胞中表达时能够结合靶抗原。本公开的逆转录病毒载体包含逆转录病毒衣壳，其包含可以感染哺乳动物细胞并将重组病毒基因组递送到哺乳动物细胞中的包膜。逆转录病毒载体可用于在体内转化细胞，从而消除当前过继性细胞疗法中进行离体细胞分离的需要。mirna去靶向结构域包含靶向序列，该靶向序列可以被不期望病毒基因组表达的细胞中产生的mirna结合。这些细胞中mirna的结合可结合mirna靶向序列并阻止病毒基因组在细胞中的表达。[0128]本公开还提供了治疗患有癌症的受试者的方法。该方法包括在体内诱导car的表达，无需体外免疫细胞操作。该方法可以包括：鉴定待治疗的疾病或病症的特异性靶抗原；构建具有结合结构域的嵌合抗原受体，该结合结构域靶向疾病或病症的特异性抗原；将car编码序列克隆到本公开载体中；生成包含编码car构建体的多核苷酸的病毒构建体，并施用该病毒构建体，使得受试者的免疫细胞在体内被转导以表达car。[0129]本公开载体可以按照本文的描述产生、纯化以及制备成用于向受试者施用的药物剂型。[0130]在另一个实施方式中，本公开提供了一种在受试者中动员干细胞(例如造血干细胞)的方法，所述受试者计划经受、正在经受或已经经受使用本公开载体的治疗。[0131]本公开提供了动员造血干细胞的多种方式。造血干细胞和祖细胞(hspc)位于骨髓环境中的不同壁龛(niche)中，由几种细胞类型组成，例如成骨细胞、网状/间充质细胞、内皮细胞、巨噬细胞和巨核细胞。这些壁龛细胞具有调节功能，限制hspc进入细胞周期，并通过有限数量的能够维持和再生hspc池的hspc来确保造血系统的终生群体恢复(repopulation)。可以将hspc从这些壁龛动员到血液中，这种动员可以由生长因子、药物、抗体等诱导。一旦被动员，hspc就会经过血流并回到造血部位。本公开提供了几种不同方法来有效地这样做，从而允许血液中的造血干细胞(hsc)在返回到相对难到达的骨髓壁龛之前被转导。[0132]本公开还提供了将逆转录病毒载体靶向hsc的方法，该方法使用逆转录病毒衣壳上的包膜，逆转录病毒衣壳具有被设计为与这些细胞表面上展示的表位结合的部分。[0133]成骨细胞通过它们表达的可溶性因子和膜定位因子来调节hspc的休眠或增殖。例如，成骨细胞在与cd34+hspc接触或者用甲状旁腺激素(pth)或局部产生的pth相关蛋白(pthrp)通过pth/pthrp受体(ppr)刺激时会产生造血生长因子，例如粒细胞集落刺激因子(g-csf)和肝细胞生长因子(hgf)。此外，在pth存在下培养的骨髓基质细胞获得了维持长期骨髓原始细胞(ltc-ic)的能力，pth的应用增加了具有骨髓群体恢复活性的hspc。因此，pth可以通过影响成骨基质细胞上的hspc的相关生长信号来调节hspc的增殖(calvi等，2003)。[0134]支持hspc的成骨细胞还具有n-钙粘蛋白+cd45-的显著表型，并且受骨形态发生蛋白(bmp)的调节。这些成骨细胞表达趋化因子，例如cxc基序趋化因子12(cxcl12，也称为基质细胞衍生因子1(sdf1))，以及干细胞因子(scf)、白细胞介素6(il-6)和notch配体jagged 1(jag1)。例如，通过pth/pthrp活化成骨细胞中jag1的prr，增加hspc中的notch信号会增加hspc的数量而不影响成熟造血细胞；而通过γ-分泌酶抑制notch活化来阻断notch信号会减少长期群体恢复的hspc的数量(calvi等，2003；stier等，2002)。[0135]成骨细胞还表达血管生成素-1，它与hspc上的tie2受体结合以支持hspc休眠、hspc与骨区域的粘附以及hspc的维持(arai等，2004)。成骨细胞还表达血小板生成素(tpo)，它激活骨髓中休眠hspc上表达的mpl受体。tpo/mpl的相互作用上调hspc中的β1-整合素和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，从而诱导hspc的休眠；而用抗mpl中和抗体抑制tpo/mpl通路会降低休眠hspc的数量(yoshihara等，2007；qian等，2007)。[0136]另一个调节成骨壁龛中原始hspc增殖的因子是骨桥蛋白，它限制了骨髓壁龛中的原始细胞扩增。骨桥蛋白由成骨细胞产生，原始hspc在体外通过β1整合素表现出对骨桥蛋白的特异性粘附(nilsson等，2005)。缺乏或抑制骨桥蛋白导致人cd34+hspc上的基质jag1和notch1受体的表达显著增加，从而导致长期群体恢复hspc的数量增加(stier等，2005；iwata等，2004)。[0137]骨髓基质还含有成纤维细胞样细胞，该成纤维细胞样细胞是骨髓细胞的粘附部分的一部分，当把骨髓置于长期培养条件下时该成纤维细胞样细胞形成支持造血作用的粘附层。这些成纤维细胞间充质细胞可以分化成多种谱系，例如成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞，并被称为骨髓基质细胞、间充质干细胞(msc)、外膜网状细胞(arc)和stro-1细胞。可以通过使用识别细胞表面标志物的抗体来识别和分离这些细胞，所述标志物例如为stro-1、sh2、sh3、sh4、nestin、血小板衍生生长因子受体a(pdgfra)、cd51、cd146，并且这些细胞为cd45阴性、cd31阴性和ter119阴性(simmons等，1994；sacchetti等，2007；mendez-ferrer等，2010；pnho等，2013)。表达间充质细胞标志物ng-2(cspg4)的小动脉血管周细胞也维持hspc休眠(kunisaki等，2013)。[0138]特别地，nestin是非造血msc的小亚群的标志物，其在空间上与hspc和肾上腺素能神经纤维相关(mendez-ferrer等，2010)。大多数hspc与表达大量趋化因子cxcl12的基质细胞(称为“cxcl12丰富的网状细胞”)密切接触，其围绕着血窦内皮细胞或位于骨内膜附近(sugiyama等，2006)。cxcl12在nestin+基质细胞中的表达高于在nestin-基质细胞中的表达》50倍，高于在原代成骨细胞中的表达》10倍。nestin+msc的耗竭导致未成熟hspc减少50％和归巢到骨髓的hspc减少90％。此外，施用pth诱导nestin+msc的增殖、它们向成骨细胞的分化以及hspc池的增加(mendez-ferrer等，2010；adams等，2007)。[0139]此外，与nestin-msc相比，nestin+msc高表达hspc维持基因scf/c-kit配体、il-7和血管细胞粘附分子-1(vcam-1)，以及作为hspc维持的反调节剂骨桥蛋白。此外，通过nestin+msc中间隙连接蛋白43和45的高表达证实，cxcl12丰富的网状细胞受交感神经系统的支配，表明它们与？-肾上腺素能神经末梢的机电耦合，施用？3肾上腺素能受体激动剂可以增强hspc的动员(katayama等，2006)。[0140]内皮细胞也有助于hspc壁龛的信号。骨髓血管结构的成像显示，85％的长期群体恢复hspc在血窦血管的10μm范围内，并与瘦素受体+、高cxcl12的基质壁龛细胞接触(acar等，2015)。最近的研究还表明，在骨髓中超过94％的以表达hoxb5为标志的hspc位于血管的外腔位置，并直接附着于表达ve-钙粘蛋白(cdh5)的内皮细胞(chen等，2016)。[0141]hspc与人血窦内皮细胞的直接细胞接触，通过notch配体jagged 1(jag1)、jag2、δ样配体4(dll4)、dll1和衍生自dll1的内皮靶向合成融合蛋白，增加hspc的群体恢复潜力和自我更新；其他notch配体可以增强hspc再生(butler等，2010；tian等，2013)。虽然notch信号对于成人hspc的稳态不是必需的，但notch-配体的粘附相互作用维持hsc的休眠和壁龛的滞留；根据最近的报道，notch2阻断(但不是notch1阻断)使hspc对动员刺激敏感并导致增强的从骨髓到外周血的外出(wang等，2017)。[0142]另一方面，据报道通过单克隆抗体破坏ve钙粘蛋白依赖性和血管内皮生长因子受体2(vegfr2)依赖性血管生成信号通路(对内皮细胞存活很重要)3天，也会破坏造血细胞中的notch信号，导致hspc频率降低，并诱导分化(butler等，2010)。在化疗期间，包括小动脉和血窦内皮细胞在内的血窦血管受到剂量依赖性损伤，vegfr2对它们的再生和hspc的重建至关重要(hooper等，2009)。[0143]其他调节hspc增殖的因子包括内皮细胞和表达瘦素受体的血管周细胞中的干细胞因子(scf)(ding等，2012)。由骨髓血窦内皮细胞表达和分泌的肝素结合生长因子多效生长因子也被证明可以调节造血干细胞的自我更新和滞留(himburg等，2012)。此外，缺失内皮细胞特异性粘附分子e-选择素会诱导hspc休眠的增加，表明内皮细胞也可以调节hspc的增殖(winkler等，2012)。[0144]还发现hspc与骨髓巨噬细胞接触，这支持成骨细胞的存活和hspc在其壁龛中的滞留(chow等，2011；christopher等，2011)。cd169+(siglec1)巨噬细胞的耗竭导致hspc在骨髓间充质(arc)壁龛中的滞留减少，因此hspc被动员在血流中(chow等，2011)。此外，g-csf诱导骨内巨噬细胞的耗竭，导致对成骨细胞功能和hspc动员的抑制(winkler等，2010)。[0145]还发现hspc与巨核细胞直接接触，这也有助于hspc壁龛。巨核细胞通常分泌细胞周期调节因子，例如血小板生成素(tpo)、转化生长因子？1(tgf-？1)和趋化因子cxc基序配体4(cxcl4)，将hspc保持在细胞周期的g0期(nakamura-ishizu等，2014；bruns等，2014；zhao等，2014)。事实上，据报道在骨髓中tgf-β1在巨核细胞中的表达高于任何其他类型的基质细胞，包括成骨细胞、内皮细胞、nestin+血管周细胞和cxcl12丰富的的网状细胞；然而，在5-氟尿嘧啶(5-fu)等化疗药物的化学毒性应激下，巨核细胞分泌成纤维细胞生长因子1(fgf-1)并下调tgf-β1，从而刺激hspc的扩增(zhao等，2014)。[0146]hspc的动员是一个多因素过程，通过调节hspc和骨髓基质之间的相互作用在骨髓微环境水平上调节hspc的动员。粘附分子、旁分泌细胞因子和趋化因子与这种相互作用有关。将hspc锚定在壁龛和/或诱导它们休眠的主要因素是血管细胞粘附分子(vcam)-1、cd44、造血生长因子(例如干细胞因子(scf)和flt3配体)、趋化因子(包括cxcl12、生长调节蛋白β和il-8)、蛋白酶、肽和其他化学递质(例如核苷酸)。动员通过脱离基质粘附来开始，然后定向迁移到骨髓窦，随后通过基底膜和内皮层出来。[0147]hspc展示出广泛的细胞粘附分子(cam)，具有在骨髓基质细胞上发现的配体。许多cam-配体对在动员和归巢过程中的作用和贡献在很大程度上是未知的。然而，与驻留在骨髓中的祖细胞相比，几种白细胞粘附分子，包括整合素lfa-1(淋巴细胞功能相关抗原1)和vla-4(极迟抗原4或整合素α4β1)，在循环祖细胞上的表达被降低。在骨髓内皮细胞和基质细胞上发现了这些粘附分子各自的配体：细胞间粘附分子-1或icam-1，以及血管细胞粘附分子-1或vcam-1。主要地，vcam-1蛋白是vla-4(α4β1)的内皮配体，并与lpam(淋巴细胞派尔集合淋巴结粘附分子或整合素α4β7)弱结合。超过90％的纯化外周血cd34+细胞表达vla-4(α4β1)整合素，而仅有10％至15％表达vla-5(整合素α5β1或纤连蛋白受体)。vla-4(α4β1)整合素单独影响粘附，而vla-4(α4β1)和vla-5(α5β1)均介导克隆源性cd34+祖细胞对重组纤连蛋白的趋化性(carstanjen等，2005)。[0148]骨髓中hspc从基质细胞中的释放受到弹性蛋白酶和组织蛋白酶g对vcam-1的蛋白水解降解以及中性粒细胞蛋白酶对cxcl12的蛋白水解降解的影响(levesque等，2002)。此外，已发现通过基质金属蛋白酶9(mmp-9)使膜结合scf脱落有助于hspc动员(heissig等，2002)。这些发现指出了在用g-scf刺激后以及在用其他刺激因素(例如趋化因子或化疗)刺激后，hspc动员中的共用“末端途径(end pathway)”。[0149]早期研究显示，非人灵长类动物中vla-4和vcam的抗体可以动员祖细胞和/或抑制它们向骨髓的归巢(papayannopoulou等，1995；papayannopoulou和nakamoto，1993)。随后，使用功能阻断性抗vla-5抗体和抗cd44抗体进行的研究表明，不仅hspc和基质细胞之间的vla-4/vcam-1相互作用、而且vla-5(？5？1；纤连蛋白受体)/纤连蛋白和cd44/透明质酸/骨桥蛋白相互作用对hspc在骨髓壁龛中滞留具有重要性，所有这些都导致释放hspc以及将它们动员到血液中(vermeulen等，1998；van der loo等，1998)。重要的是，针对vla-4(α4β1)和vla-5(α5β1)的抗体独立地减少移植人外周血cd34+细胞之后的骨髓的群体恢复(carstanjen等，2005)。[0150]那他珠单抗是一种人源化的单克隆抗vla-4抗体，被fda批准用于治疗多发性硬化症和克罗恩病患者。对接受那他珠单抗输注治疗多发性硬化症的患者的连续测量显示，循环cd34+细胞显著增加约3倍(zohren等，2008)。在造血干细胞移植和干细胞疾病的情况下，单独使用那他珠单抗或将那他珠单抗与细胞毒性药物或其他抗体组合使用可能是一种新的干细胞动员方式(neumann、zohren和haas，2009)。[0151]hspc上粘附分子的低表达或亲和力的降低也可能促进它们从骨髓中的动员。例如，已显示特定细胞因子(例如白细胞介素(il)-3、粒细胞-巨噬细胞csf(gm-csf)和kit配体(kl))能够改变在cd34+细胞上表达的vla-4和vla-5的功能，从而调节对纤连蛋白的粘附(levesque等，1995)。相反，据报道在干细胞因子(scf)刺激后，cd34+hspc上vla-4和vla-5的表达分别增加了约2倍和4至10倍，导致在用scf刺激后对纤连蛋白的粘附增加(hart等，2004)。[0152]此外，骨髓血窦中ephb4受体和造血细胞中肝配蛋白b2配体的互斥分布表明了这些分子的相互作用在hspc动员中的作用。在小鼠中阻断ephb4/肝配蛋白b2信号通路会减少hspc和其他骨髓细胞向血液循环的动员(kwak等，2016)。[0153]本公开的药物组合物可包含本文所述的病毒载体以及一种以上药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含：缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如edta或谷胱甘肽；佐剂，例如氢氧化铝；以及防腐剂。本公开的组合物可被配制为用于静脉内施用的剂型。该组合物还可以包含第二活性剂(例如抗癌剂、抗病毒剂或抗生素剂)。[0154]本公开的药物组合物可以按照适合待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将取决于患者的病况、患者疾病的类型和严重程度等因素。当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”或“抗感染”时，可以由医师考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的病况的个体差异视可能的情况来确定本公开的组合物的施用量。通常而言，药物组合物的剂量是足以引起足够治疗疾病或病症的免疫效应细胞(例如t细胞、nk细胞)转导的量。在一个实施方式中，本公开的药物组合物包含103至1011(例如103、104、105、106、107、108、109、1010、1011或任何上述两个值之间的任何值)个转化单位/剂量的载体。该剂量可以每天施用一次至数次，并且可以根据在体内诱导免疫效应细胞的需要施用连续的天、周或月。可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术来施用包含本公开载体的药物组合物(参见例如rosenberg等，new eng.j.of med.319:1676,1988)。[0155]将参考以下实验例对本公开作进一步说明。提供这些实施例仅用于说明目的，除非另有说明，否则不旨在是限制的。因此，本公开决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变型。实施例实施例1[0156]含有mirna靶序列的重组逆转录病毒载体的选择性转基因表达的体外测试[0157]该实验使用含有转基因的rnv进行，其包含该转基因的转录编码rna内的microrna靶序列。通过实施例2至6中描述的任何方法制备感染性载体。作为惯例，质粒名称在全名之前有一个小“p”，相应的感染性载体具有相同的名称，但没有“p”或在前面或后面有“v”。因此，pba9-9b-hcd19-mirt223t4x是指携带来自pba-9b(seq id no：1，其中“u”可以是“t”)的病毒骨架、含有抗人cd19car的编码序列和4个拷贝的mir223靶序列的质粒(例如构建体7)；ba-9b-hcd19-mirt223t4x或vba-9b-hcd19-mirt223t4x或ba-9b-hcd19-mirt223t4x(v)代表相应的感染性载体。表达同源microrna的细胞会降解包含mirna靶序列的rna，从而限制转基因在该类细胞中的表达。转基因可以包含每个microrna靶序列的1个以上拷贝。在本实施例中，转基因编码cd19嵌合抗原受体，在转录物的3'端有或没有每个mirna靶序列的4个拷贝。在一个实施方式中，microrna靶序列编码4个重复的mir223靶标(“mir223t(4x)”)以降低转导的单核细胞中转基因的表达(图1，构建体7，seq id no：2)。在一个实施方式中，microrna靶序列编码b细胞(淋巴瘤)特异性mirabct(4x)以降低转导的b细胞中转基因的表达(图1)。在一个实施方式中，microrna靶序列编码mirankt(4x)以减少转导的nk细胞中转基因的表达(图1)。在一个实施方式中，microrna靶序列编码mirabct(4x)和mir223t(4x)以减少转导的b细胞和单核细胞中转基因的表达(图1，构建体5)。在一个实施方式中，microrna靶序列编码mirankt(4x)和mir223t(4x)以减少转导的b细胞和单核细胞中转基因的表达(图1)。在一个实施方式中，microrna靶序列编码mirankt(4x)、mirankt(4x)和mir223t(4x)以降低转导的b细胞和单核细胞中转基因的表达(图1)。在另一个实施方式中，rnv还可以在转基因的utr中包含导致肝细胞中转录物降解的mirna靶序列。作为单个靶标添加或与utr组合添加mirna122at(4x)和mir199at(4x)序列可降低肝脏中转基因的表达(图2，构建体36、37、38)。这些肝脏去靶向mirna可以与图1中的组分组合，包括所有5个mirna靶序列都被编码在rnv转基因utr中的组合(图2)。[0158]seq id no：1中提供了本公开的rna病毒多核苷酸(vrna基因组)，粗体/下划线部分标识了多克隆位点：分标识了多克隆位点：[0159]可以将car构建体(有或没有附加的结构域，例如mirna靶向结构域、杀伤开关结构域等)克隆到多克隆位点中。[0160]为了确认mirna靶序列在不同细胞类型中的特异性和功能，使用含有祖母绿gfp(emerald gfp)的rnv代替cd19car以观察pmbc细胞类型以及不同细胞系中的转基因表达。使用图1中描述的含有emdgfp的ba9b载体的mir变体转导以下细胞系：jurkat(t细胞)，tall-104(t细胞)，raji(b细胞)，nalm-6(b细胞)，thp-1(单核细胞)，u937(单核细胞)和nk-92(nk细胞)。作为阳性对照，使用第三代sin-慢病毒载体转导ht1080细胞，表达单一或不同的前体mirna组合以及嘌呤霉素。使用嘌呤霉素(6ug/ml)对转导后的ht1080进行两周的选择，之后进行rnv转导(编码在utr中具有mirna靶序列的所需的转基因)。这确保了至少一个被转导的细胞系将表达期望的mirna，以靶向rnv转基因的utr从而进行降解。例如，在用构建体5转导的细胞中，仅那些不表达mrna靶序列的同源mirna的细胞系显示出egfp的表达，如表2中所总结的。使用相同的表达gfp的载体转导pbmc，相似的结果显示基本上仅t细胞以可评估的的水平和频率表达gfp转基因(图3)。[0161]表2：用ba9b-cd19car-mirabct4x-mirankt4x-mir223t4x转导后的gfp表达(预测)[0162]同时，使用ba9b-cd19car-mirabct4x-mirankt4x-mir223t4x载体在聚凝胺(4-8μg/ml)存在下的混合淋巴细胞反应中以10moi转导pbmc。一百万个pbmc在24孔组织培养板的单孔中以1e6/ml的密度接种在添加10％ fbs的rpmi1640培养基中。转导后24-48小时，对细胞进行取样，在细胞仪上运行以评估cd19car特异性表达的细胞类型(图3)。通过流式细胞术，仅表达cd4或cd8经典标志物的t细胞显示cd19car的表达，而其他细胞类型(包括b细胞、nk细胞和单核细胞)不显示cd19car的表达。此外，由于t细胞的cd19car活性，可以在pbmc培养物中看到cd19+b细胞频率降低。此外，表达cd19car的t细胞可能会在进行一些下文所述的体外测定期间被富集。[0163]对于重编程t细胞的cd19 car的特异性活性，进行了多种短期和长期的细胞测定以测量car介导的增殖、细胞内的和分泌的细胞因子的产生以及针对nalm6-cd19wt和nalm6-cd19 ko肿瘤细胞系的细胞毒性。肿瘤细胞系nalm6-cd19wt购自atcc，并保持在添加10％胎牛血清的培养基rpmi-1640中，用于与重编程t细胞共培养以测试cd19car的活性。为了测量重编程t细胞的cd19car非特异性活性，使用crispr技术从原始nalm6-cd19wt亲本肿瘤细胞系产生nalm6的cd19抗原缺陷变体(nalm6-cd19ko)。收集重编程cd19 car-t细胞与nalm6在不同效靶(e:t)比16:1、8:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4和1:8下的共培养物的上清，以使用酶联免疫吸附测定(elisa)和流式细胞术(使用biolegend的legendplex测定法)来测量分泌的细胞因子水平。重编程的car-t细胞以cd19 car特异性的方式只在有nalm6-cd19wt、而不在有nalm6-cd19ko的培养物的上清液中分泌il2、ifnγ和tnf等细胞因子。在分别与nalm6-cd19wt和nalm6-cd19ko细胞系短期共培养4小时后，使用基于流式细胞术的方法检测表达car的重编程t细胞的脱粒(cd107动员)和细胞内细胞因子。重编程car-t细胞以cd19 car特异性的方式，在与nalm6-cd19wt而不是nalm6-cd19ko的共培养物中脱粒，并在细胞内保留il2、ifn和tnf等细胞因子。为了使用流式细胞术测量car介导的重编程t细胞增殖，用rnv-hcd19处理celltrace violet(ctv)标记的pbmc的总汇集物，然后分别与naml6-cd19wt和nalm6-cd19ko细胞系共培养72小时。仅重编程t细胞以car特异性的方式优先在有nalm6-cd19wt而不是有nalm6-cd19ko的培养物中增殖。[0164]在短期的和长期的共培养测定中，当重编程t细胞和nalm6-cd19wt的共培养与重编程t细胞和nalm6-cd19ko的共培养相比较时，重编程t细胞还显示出cd19car特异性的肿瘤细胞毒性。使用基于发光的方法测量针对表达荧光素酶的naml6-cd19wt的短期即刻的car特异性细胞毒性。还使用agilent的xcelligence测定法测量针对nalm6-cd19wt的短期和长期car特异性的肿瘤细胞毒性。xcelligence测定法使用嵌入培养板中的生物传感器对nalm6肿瘤细胞系数量的任何变化进行连续实时细胞分析(rtca)。与nalm6-cd19ko细胞相比，以不同e：t比添加重编程t细胞表现出nalm6-cd19wt的cd19 car特异性杀伤。此外，72小时的xcelligence测定显示出nalm6-cd19wt肿瘤细胞系的car特异性杀伤和生长抑制。实施例2[0165]在亲本ht-1080细胞中表达mlv衍生的gag/pol和env的工程化改造版本、编码质粒结构的hal2包装细胞系[0166]hal2包装细胞系的开发方式与“sheridan等，molecular therapy，第2卷，第3期，2000年9月”中描述的ha-lb包装细胞相似。对于本实施例，还可以使用在“sheridan等，mol.ther.2000”中描述的haii包装细胞系。本文描述了hal2包装细胞质粒构建体以及用于haii包装细胞系的构建体。将质粒构建体稳定转染到亲本ht-1080细胞系(atcc-ccl-121)中。或者，对于本领域技术人员而言，也可以使用用vsg-g假型化的慢病毒载体插入和表达gag/pol和env mlv衍生序列，以在连续转导事件中稳定地转导mlv序列，以获得相似的hal2包装细胞系。在gag/pol序列稳定转染或转导后，表达gag/pol的ht-1080中间体被稀释克隆，通过蛋白质印迹分析筛选出高gag/pol p30表达的单个克隆。也可以通过使用mlv载体转导gag/pol克隆中间体来筛选克隆以获得功能性滴度的产生，其中mlv载体含有5'ltr和3'ltr，5'ltr和3'ltr在包装信号、选择标记(例如新霉素抗性)或标记基因(例如祖母绿gfp)的侧翼，它还表达功能性mlv env序列，以确定gag/pol包装细胞系中间体能够产生高滴度mlv病毒颗粒。在确认生产良好滴度载体的潜力后，通过使用编码mlv env序列的慢病毒载体的稳定转染或稳定转导，将mlv env序列插入选择的gag/pol中间体。在递送mlv序列之后，表达gag/pol和env的包装细胞系被稀释克隆并筛选以鉴定最高的env表达以及确认功能滴度的产生，使用能够表达选择标记或标记基因的相似(除了没有病毒env)mlv测试载体以评估单个克隆包装细胞系的性能。下面进一步描述了用于创建hal2包装细胞系的特定mlv gag/pol和env构建体。[0167]momlv衍生的gag/pol构建体。hal2包装细胞系使用原始的momlv衍生的gag/pol质粒pscv10(参见例如wipo专利公开wo91/06852和wo92/05266，其各自的公开内容通过引用整体并入本文)，如用于ha-lb mlv包装细胞系，旨在减少通过同源重组事件产生具有复制能力的病毒。也可以使用haii包装细胞系中的gag/pol构建体，它降低了与逆转录病毒载体和env表达构建体的序列同源性。在haii中，gag/pol构建体表达盒pci-wgpm含有在gag的编码区约前400nt中的简并密码，并且所有的5'和3'非翻译序列是缺失的。此外，编码pol基因的最后28个氨基酸的序列是缺失的，产生截短的整合酶基因。质粒pci-gpm和pscv10/5',3'截短型含有与pci-wgpm相同的gag/pol cdna，除了gag的5'区含有天然序列。[0168]momlv衍生的兼嗜性包膜构建体。为了减少gag/pol和逆转录病毒载体质粒中的序列重叠，使用原始4070a衍生的兼嗜性表达质粒pcmvenvamdra(专利申请wo 91/06852)生成两个质粒，这两个质粒如在ha-lb包装细胞系中所使用地在env终止密码子后面的所有3'非翻译序列是缺失的(pcmvenvamdralbgh)，或者如在haii包装细胞系中所使用地所有3'和5'非翻译序列都是缺失的(pcmv-β/envam)。[0169]使用pba-9b-emdgfpmir233-3p4txv2 mlv质粒载体，由hal2创建载体生产细胞系(vpcl)以生产编码祖母绿gfp和mirna序列的mlv病毒颗粒，用于下调脱靶的或非预期的特定细胞类型中的载体表达[0170]对质粒构建体pba-9b-emdgfpmir233-3p4txv2(构建体7)进行修饰以进行细胞特异性去靶向。可以修饰基本的pba-9b-emdgfp序列，使其也编码microrna(mir)靶序列，作为以细胞类型特异性方式下调载体表达的有效方法，以增加载体的安全性并防止在非预期细胞类型中的表达。图5显示了使用mir靶序列阻止骨髓细胞、b细胞和nk细胞类型中的表达的示例。[0171]使用高多重性转导(“m.o.t.”)“高m.o.t.”方法(m.o.t.》20)，由选定的hal2克隆包装细胞系建立逆转录病毒非克隆载体生产细胞系以及随后的生产克隆，其使用vsv-g假型mlv载体颗粒进行单轮或多轮背对背(back-to-back)转导。多重性转导被定义为每个用于产生vpcl非克隆细胞系的pcl细胞使用的感染性病毒颗粒的数量。通常，pcl培养物在转导前一天按照1×105个细胞/孔接种在6孔板中。然后将适当体积的载体上清液添加到pcl中(在4、5、6、7或8μg/ml聚凝胺的存在下，分别对应于0.1、0.5、5、25和125的m.o.t.)。在20-24小时后，用2ml新鲜培养基替换载体上清液。为了增加m.o.t.，可以第二天使用相同体积的载体上清液重复转导过程。生产细胞汇集物生长至汇合，在汇合后24、48和72小时每天收集上清液，以确定pcr转导滴度并显示基因表达的转移。选定的非克隆汇集物使用有限稀释接种到96孔板来进行克隆，实现每孔单个细胞，随着单个克隆组的扩增，通过几轮滴度测定和表达转移测定对其进行分析。将可持续高滴度生产的vpcl克隆冷冻保存，以制备经过安全性测试(无菌性、支原体、具有复制能力的逆转录病毒以及其他病毒外来剂，如fda的考虑要点和指南出版物中所述)的冷冻下来的工作储备物。作为合格细胞库储备物表征的一部分，还对源自单个克隆的病毒颗粒进行病毒基因组测序以确保基因组mlv序列的准确性。一旦合格，可对来自合格细胞库储备物的小瓶进行进一步扩增，并在gmp下进行进一步测试，以生产gmp master细胞库和工作细胞库储备物。图6概述了创建包装细胞系或载体生产细胞系的一系列事件。实施例3international，伊利诺伊州)，以达到接种系统所需的细胞数量。根据葡萄糖的消耗控制新鲜培养基灌注进料，每天最多更换4个系统体积的培养基。取决于使用的cell cube模块的数量，生产体积在至多约13-16天的时间中为200升至1000升。取代表性的生物反应器样品用于代谢曲线和pcr转导滴度分析。实施例4[0179]ht-1080mulv病毒载体生产细胞系从血清和粘附依赖性到无血清悬浮培养的适应[0180]简而言之，在筛选和鉴定合适的ht-1080载体生产细胞系的稀释克隆后，进行无血清适应过程。通过将约2×107个细胞接种到125ml摇瓶中启动适应过程，该摇瓶中含有10ml含5％血清的条件培养基和10ml选择的无血清选择培养基，导致血清浓度降低2.5％。在本实施例中，无血清培养基是通过invitrogen公司(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)分销的freestyle 293 expression media，但是对于本领域技术人员而言，也可以使用类似的或定制的无血清培养基。将培养物放置在具有温度和co2气体控制的组织培养箱中的摇床上。摇床设置为约80rpm，培养箱设置为37℃和优选的5％ co2的条件。每3-7天，通过收集悬浮细胞并将其重新接种到新的摇瓶(含有10ml相同的初始条件培养基和10ml新鲜无血清培养基，保持血清水平约为2.5％)中来对培养物进行再进料。在每次再进料事件中检查培养物，根据需要进行活细胞计数以检查细胞增殖。当细胞显示出基于细胞倍增或葡萄糖消耗的生长迹象时，通过调整条件培养基和新鲜无血清培养基的体积量来达到1.67％的血清浓度目标。每3-7天再次对培养物进行检查和再进料。当细胞显示出生长迹象时，再次通过调整条件培养基和新鲜无血清培养基的体积以达到1.25％的血清浓度目标。继续该过程以达到1.0％、0.9％、0.83％血清条件的后续血清条件，直到细胞处于100％的无血清条件。在此适应过程中，细胞培养物在1,000ml摇瓶中扩增至约200ml的体积，达到约0.5至1.0×106个细胞/ml的最小活培养物目标。一旦细胞达到100％无血清条件，细胞在无血清条件下连续传代，其中通过让较重的结块细胞在不搅拌的情况下短时间沉淀来分离单个悬浮细胞。一旦培养物持续由约95％的单细胞悬液组成，则可以使用标准哺乳动物细胞冷冻条件将培养物冷冻在由10％ dmso和90％无血清培养基组成的冷冻保存培养基中。所需材料：·freestyle 293表达培养基，invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州·125ml和1000ml的通风摇瓶·dmso，usp(cryoserv,bionche pharma usa，森林湖，伊利诺伊州)实施例5[0181]生产细胞系适应悬浮培养，在摇袋生物反应器系统中生产病毒，用于中试/临床前规模生产。使用前面描述的使vpcl贴壁克隆适应成为无血清悬浮vpcl的方法，使用一系列摇瓶启动细胞扩增，每个摇瓶含有指定量的细胞培养基：125ml(20ml培养物)、250ml(40ml)、500ml(100ml)和1l(200ml)，所有摇瓶均来自康宁。使用添加了0.1％人血清白蛋白(hsa，来自octapharma，美国，新泽西州)的完全成分确定的无血清培养基(freestyle 293expression media，gibco cat#12338)进行细胞扩增。培养物在37℃和5％ co2条件下孵育，摇床速度约为80rpm。使用5个1l摇瓶培养物接种wave生物反应器(wave 20/50eht，cytiva healthcare life sciences/ge healthcare，马塞诸塞州)，其中包含工作体积为10l的20l cellbag。在37℃下，生物反应器中的初始细胞密度约为4×105个活细胞/ml(活力91％)。初始操作条件为：5％ co2，摇速15rpm，角度6°，空气流速0.2l/min。ph控制设置为约7.2，do控制为约40％。ph和do控制均由wave pod控制台系统实现。[0182]在细胞密度达到～1×106个活细胞/ml后，使用中空纤维(部件号cfp-6d-6a)筒(cytiva healthcare life sciences/ge healthcare，马塞诸塞州)开始细胞灌注过程。进料(和渗透)速率最初设定为～0.25体积/天，随着细胞密度逐渐增加，至多到～3.8体积/天。在15天内收获了总共180l含有病毒的渗透物。可以使用25l工作体积的50l wave袋收集约300l的收获材料。180l-300l收获物中的病毒滴度可以是5-8×106tu/ml。[0183]使用一次性生物反应器(sub)灌注系统的悬浮液适应的vpcl的大规模载体生产。作为sub生物反应器放大示例，使用具有最小52l工作体积的100l sub(thermo fisher scientific)系统来生产约900-1000l的澄清载体。如之前所述的进行细胞扩增以接种wave生物反应器摇摆系统。在sub接种后，与wave类似，通过使用灌注程序，在低温2-8℃的一次性混合器(sum)中连续地添加新鲜培养基和收集澄清渗透物(在14至21天的时间内)，使细胞生长至更高的细胞密度。[0184]在生物反应器接种后约3天开始对培养物进行灌注进料。细胞培养基是gibco freestyle 293表达培养基(thermo fisher scientific)，在使用前添加了0.1％人血清白蛋白(hsa)，并添加了低浓度的基于聚二甲基硅氧烷的消泡剂，例如anti-foam b(sigma-aldrich)。[0185]在sub生物反应器系统的灌注过程中，悬浮细胞保留在细胞培养循环中，而含有载体产物的细胞培养上清液在通过具有0.45μm标称孔径的中空纤维筒进行切向流微滤后被收获。“渗透物”或澄清的载体收获物被收集到在带有夹套的一次性混合器(sum)内的一次性收获袋中，该混合器被控制在2-8℃。第5至第9天之间开始收获物的收集，此时细胞密度达到3-5×106个活细胞/ml。收集过程持续11至17天。当获得约900-1000l的澄清载体收获物时生产运行结束，从接种生物反应器开始约需要14至21天。[0186]在整个生产细胞系扩增和载体生产过程中，生物反应器的温度控制在37℃。通过控制器自动添加碳酸氢钠将ph值控制在7.20±0.15，通过把o2喷到生物反应器中将溶解氧控制在40％饱和设定点。co2气体流量设定为空气流量的5％。在线监测葡萄糖水平，作为进料速率增加的指标。当生物反应器中的细胞密度达到约2.5×106个活细胞/ml，或生物反应器中的葡萄糖水平降低到0.5g/l(从最初的5g/l)时，开始灌注新鲜培养基。随着细胞密度随时间增加，进料速率增加。通过applikon控制器自动提高进料速率，该控制器利用基于bioxpert w7软件(applikon生物技术)的用户特定的和开发的自动化代码。由于生物反应器中营养物质的消耗随着细胞密度的增加而增加，新鲜培养基被送入生物反应器以补充葡萄糖和营养物质的消耗。随着培养基进料速率的增加，从切向流中空纤维筒中取出澄清载体收获物的速率也随之增加。基于生物反应器的在线葡萄糖测量，进料速率和渗透物速率的增加都是自动化的。生物反应器的重量(体积)也可以使用系统来控制：在渗透物速率与进料速率同时增加之后，通过相同的用户特异性自动化代码调节渗透物速率(从生物反应器中取出的体积)。实施例6[0187]病毒的纯化和浓缩。纯化的病毒制剂不仅用作临床使用的药物制剂，而且还被需要用于(1)elisa板的包被，作为纯化的捕获抗原以检测抗病毒抗体，和(2)作为纯化的免疫原性抗原在动物中产生阳性对照抗病毒抗体，用于elisa测定或其他免疫原性病毒检测方法。本公开的病毒以多种方式制造：通过瞬时转染293t、表达mlv gag-pol的293细胞系(例如参见burns等，pnas 90:8033-8037 1993)或ht1080细胞，或来自载体生产非克隆细胞系汇集物，或来自克隆载体生产细胞系。取决于细胞系的适应情况，培养基可以是有血清的或无血清的，细胞可以作为贴壁细胞或悬浮细胞生长，细胞培养上清液以分批收获物的形式收集或在灌注模式下收集，在2-8℃冷藏条件下保存。收获培养物上清液，在4℃下储存至多2周。通过封闭端0.45微米过滤筒或通过使用中空纤维筒的切向流微滤或板框过滤系统对大量收获物进行过滤，去除大细胞碎片。过滤后，在2mm mgcl2的存在下用2-5单位/ml(emd millipore，damstadt germany)处理载体，在4℃的最低温度下孵育过夜15-30小时以消化细胞dna(shastry等，hum gene ther.,15:221,2004)，然后进行浓缩步骤。[0188]可以使用切向流超滤或通过阴离子交换色谱法进行浓缩步骤。对于超滤，病毒载体材料的浓缩使用500mw截留膜实现，该膜被设计用于将大病毒颗粒保留在再循环回路中。在对系统进行消毒和中和后，后处理的载体材料在再循环回路中浓缩，该回路从浓缩容器开始、通过蠕动泵、通过500mw中空纤维筒、然后返回浓缩容器。一旦所有空气都从再循环系统中排出，渗透物出口打开以开始浓缩过程。渗透物流量被设置为再循环速率的流速的约1/10。再循环速率取决于中空纤维筒的尺寸，但通常将其设置为泵速和剪切速率不会对病毒造成损害的最大速度的约75％。随着渗透废物的收集，将额外的载体材料添加到回路中，直到材料达到期望的浓缩范围，通常滴度增加10到50倍，体积相应减少。一旦达到目标浓度，使用制剂缓冲液将载体渗滤和缓冲液交换到期望的ph中性、等渗tris缓冲蔗糖溶液中。然后可以将该材料过滤灭菌并按原样使用或可以进行进一步的色谱纯化。可通过以下方式使用精制色谱：(1)多峰树脂，例如capto core 400(cytiva/ge healthcare)，可进一步去除小分子量的带电蛋白质；或(2)使用标准尺寸排阻色谱，例如s-500树脂(cytiva/ge healthcare)，起到缓冲液交换以及去除小分子量蛋白质的作用。色谱分析后，载体可以与期望的赋形剂一起配制从而提供稳定性，0.2μ灭菌过滤，装瓶，在-65℃以下冷冻。[0189]作为超滤的替代方案，也可以使用aex色谱法实现载体浓缩(参见例如美国专利号5,792,643；rodriguez等，j gene med.，9：233，2007；sheridan等，mol.ther.,2:262-275,2000)。将benzonase处理的病毒制剂加载到阴离子交换柱上，在逐步的nacl梯度中洗脱病毒。含有病毒的部分可以通过pcr检测或通过a215、a280和a400进行鉴定。收集并汇集阳性部分。随后将汇集的制剂加载到尺寸排阻柱(sec)上，去除盐以及其他剩余的小分子量污染物，并将病毒调节到sec制剂缓冲液(基于20mm tris的等渗溶液，由90mm nacl、1％蔗糖、1％甘露醇组成，用hcl调节为ph 7.2)中。sec使用制剂缓冲液在无梯度条件下运行，从空隙体积中收集来自sec柱的病毒部分。汇集鉴定为阳性的部分并补充最终到1mg/ml的人血清白蛋白，通过制剂预湿润的0.2μm无菌过滤器过滤，分装，在-65℃以下冷冻。该工艺使用的所有部件均为usp药典级材料，其制造工艺可在用于临床的gmp要求下进行。基于无菌性、支原体和内毒素等标准检测放行病毒制剂，通过sds page凝胶分析评估纯度和一致性。通过对靶细胞中整合的病毒dna进行pcr定量，将滴度确定为转导单位(tu)。最终产品的目标滴度范围为1×108至1×109tu/ml。实施例7[0190]麻疹h-cd8scfv和截短的麻疹f蛋白分子的构建和表征[0191]在另一个实施方式中，提供mlv-麻疹杂合载体以靶向cd8阳性t细胞，修饰麻疹血凝素“h”构建体以编码cd8表达细胞的特异性单链抗体的嵌合序列。在设计中，使用h蛋白胞质尾部将嵌合蛋白锚定到病毒上，其中受体结合序列缺失或被突变以破坏h受体的结合。如在表达构建体hstalkscfvhl中所证明的，受体结合使用通过连接子序列融合的cd8靶向scfv序列实现。如在表达构建体hstalkscfvlh中所证明的，改进或替代性靶向通过鉴定该受体和其他受体的特异性scfv结合序列的替代性重链和轻链序列的定向来实现。在设计中，使用了edmonston b株麻疹序列，但其他麻疹病毒株可用于提供f和h蛋白从而进行等效修饰。为了在cd8细胞结合时实现病毒融合，将没有pit2结合识别序列的单独嵌合mlv env构建体与麻疹“f”融合蛋白融合，如针对构建体edb融合p dna-4070a尾部所描述的。使用兼嗜性包膜的细胞质尾部将该嵌合构建体与病毒颗粒结合。在另一替代性设计中，也可以使用无尾f蛋白来实现病毒颗粒融合。实施例8[0192]使用具有麻疹“f”融合蛋白和“h”结合蛋白(被修饰为靶向cd8阳性t细胞)的momlv杂合包膜构建和测试具有cd 8靶向包膜的pcl/vpcl[0193]为了构建能够产生靶向cd8阳性t细胞的momlv病毒颗粒的包装细胞系，使用实施例7中描述的麻疹h-cd8scfv和截短的麻疹f蛋白构建体代替实施例2中描述的pcmvenvamdralbgh或pcmv-β/envam包膜构建体以创建包装细胞系。简而言之，通过稳定质粒转染，将编码h-cd8scfv的质粒构建体(构建体52，pcmvenvmfhlcd8dralbgh)和截短的麻疹f蛋白表达载体(构建体53，pcmvenvmtfdralbgh)依次转染到表征的gag/pol包装细胞系中间体中。如前面所指出的，本领域技术人员还可以使用工程化改造的慢病毒载体以稳定地转导具有靶向h-cd8scfv和截短的麻疹f(mf)序列的gag/pol中间体细胞系。在一个实施方式中，最初递送麻疹f蛋白载体以产生也表达麻疹f蛋白的gag/pol中间体细胞系。这允许替代性的gag/pol-mf中间体细胞系，该细胞系仅需要添加病毒杂合包膜靶向序列来创建具有替代性病毒靶向潜力的包装细胞系。这种新的gag/pol-f蛋白中间体被连续稀释以产生稀释克隆，通过蛋白质印迹分析筛选gag/pol和mf蛋白序列的最高共表达克隆。一旦鉴定出几个稳定表达的克隆，可以通过向细胞系中引入类似的能够表达选择性标记以及病毒靶向h-cd8scfv序列的mlv测试载体来对克隆进行功能测试，以评估病毒包装细胞系的性能。在进行滴度分析时，用于测试表达转移的原代幼稚细胞将需要为cd8阳性细胞，例如tall-104(atcc crl-11386)、molt4(atcc crl-1582)或经过修饰以在细胞上稳定表达cd8受体的贴壁细胞(例如pc-3(atcc crl-1435)或ht0180(atcc ccl-121))。一旦鉴定出gag/pol-mf细胞系中间体克隆，可以用靶向h-cd8scfv表达载体稳定转染或转导细胞。靶向h-cd8scfv的包装细胞系随后被连续稀释，筛选所有相关病毒蛋白序列的单个克隆：gag/pol、mf和h-cd8scfv。通过引入表达荧光标记和/或药物选择性抗性标记的mlv测试载体再次测试最高表达的克隆的功能性能，以通过转移到cd8阳性滴度幼稚细胞上的病毒颗粒表达来评估稳定的滴度生产。[0194]使用cd8靶向的mlv包装细胞系创建载体生产细胞系(vpcl)。为了使用上述cd8靶向的mlv包装细胞系产生产vpcl，使用如实施例2中所示的相同mlv载体pba-9b-emdgfpmir233-3p4txv2或替代性的mlv载体构建体稳定转染cd8靶向的pcl。或者，使用mlv载体构建体生产瞬时产生的vsv-g或兼嗜性衍生载体颗粒，以稳定地转导cd8靶向的mlv包装细胞系。如前所述，根据图6中引用的概要建立逆转录病毒非克隆载体生产细胞系以及随后的生产克隆。然而，对于本实施例，使用cd8靶向的pcl代替hal2克隆包装细胞系，使用相同的在单轮或多轮背对背转导中采用的m.o.t.》20的高多重性转导“高m.o.t.”方法，使用由gag/pol中间体细胞系产生的vsv-g假型mlv或使用通过用mlv载体瞬时转染到hal2细胞中产生的兼嗜性载体生成颗粒。通常，在瞬时转导前一天，将pcl培养物以1×105个细胞/孔接种到6孔板中。然后将适当体积的载体上清液添加到pcl中(在4-8μg/ml聚凝胺存在下)，对应于0.1、0.5、5、25和125的m.o.t.。在20-24小时后，用2ml新鲜培养基替换载体上清液。为了提高m.o.t.，可以在第二天使用相同体积的载体上清液重复转导过程。如上文所述，生产细胞汇集物生长至汇合，在汇合后24、48和72小时使用每日培养基再进料计划每天收集上清液，以确定pcr转导滴度和/或使用cd8阳性细胞系作为滴度细胞系评估基因表达的转移。使用有限稀释接种将选择的非克隆汇集物克隆到96孔板中，实现每个孔单个细胞，随着单个克隆组的扩增，使用几轮滴度测定和表达转移测定对其进行分析。具有可持续高滴度生产特性的vpcl克隆被冷冻保存，以制备经过安全测试(无菌性、支原体、具有复制能力的逆转录病毒以及其他病毒外来剂，如fda的考虑要点出版物中所述)的冷冻下来的工作储备物。作为合格细胞库表征的一部分，还对源自单个克隆的病毒颗粒进行病毒基因组测序以确保基因组mlv序列的准确性。一旦合格，可对来自合格细胞库储备物的小瓶进行进一步扩增，并在gmp下进行进一步测试，以生产gmp master细胞库和工作细胞库储备物，用于最终的临床生产。实施例9[0195]使用具有麻疹“f”融合蛋白和“h”结合蛋白(靶向cd4阳性t细胞)的momlv杂合包膜构建和测试具有cd 4靶向包膜的pcl/vpcl[0196]为了构建能够产生靶向cd4阳性t细胞的momlv病毒颗粒的包装细胞系，使用实施例7中描述的麻疹h-cd4scfv和截短的麻疹f蛋白构建体代替实施例2中描述的pcmvenvamdralbgh或pcmv-β/envam包膜构建体以创建包装细胞系。简而言之，通过稳定质粒转染，将质粒构建体h-cd4scfv和截短的麻疹f蛋白表达载体依次转染到表征的gag/pol包装细胞系中间体中。如前面所指出的，本领域技术人员还可以使用工程化改造的慢病毒载体稳定地转导具有靶向h-cd4scfv和截短的麻疹f(mf)序列的gag/pol中间体细胞系。在一个实施方式中，最初递送麻疹f蛋白载体以产生替代性的也表达麻疹f蛋白的gag/pol中间体。这允许gag/pol-mf中间体细胞系，该细胞系仅需要添加病毒靶向序列来创建具有替代性病毒靶向潜力的包装细胞系。这种gag/pol-f蛋白细胞系中间体被连续稀释以产生稀释克隆，通过蛋白质印迹分析筛选出gag/pol和mf蛋白序列的最高共表达克隆。一旦鉴定出几个稳定表达的克隆，可以通过向细胞系中引入类似的能够表达选择性标记以及病毒靶向h-cd4scfv序列的mlv测试载体来对克隆进行功能测试，以评估病毒包装细胞系的性能。在进行滴度分析时，用于测试表达转移的测试幼稚细胞将需要为cd4阳性细胞，例如ccrf-cem(atcc ccl-119)、a301或经过修饰以在细胞上稳定表达cd4受体的贴壁细胞(例如pc-3(atcc crl-1435)或ht0180(atcc ccl-121))。一旦鉴定出gag/pol-mf中间体克隆，可以用靶向h-cd4scfv表达载体转染或转导细胞。随后连续稀释靶向h-cd4scfv的包装细胞系，筛选所有相关病毒蛋白序列的单个克隆：gag/pol、mf和h-cd4scfv。通过引入表达荧光标记和/或药物选择序列的mlv测试载体再次测试其中所有蛋白质都表达最高的克隆的功能性能，以通过转移到cd4阳性测试幼稚细胞上的病毒颗粒表达来评估稳定的滴度生产。[0197]使用cd4靶向的mlv包装细胞系创建载体生产细胞系(vpcl)。为了使用上述cd4靶向的mlv包装细胞系生产vpcl，使用如实施例2所示的相同mlv载体pba-9b-emdgfpmir233-3p4txv2或替代性的mlv载体构建体直接稳定地转染cd4靶向的pcl。或者，在另一个实施方式中，使用mlv载体构建体生产瞬时产生的vsv-g或兼嗜性衍生载体颗粒，以稳定地转导cd4靶向的mlv包装细胞系。如前所述，根据图6中引用的概要建立逆转录病毒非克隆载体生产细胞系以及随后的生产克隆。然而，对于本实施例，使用cd8靶向的pcl代替hal2克隆包装细胞系，使用相同的在单轮或多轮背对背转导中采用的m.o.t.》20的高多重性转导“高m.o.t.”方法，使用由gag/pol中间体细胞系产生的vsv-g假型mlv或使用通过用mlv载体瞬时转染到hal2细胞中产生的兼嗜性载体生成颗粒。通常，在瞬时转导前一天，将pcl培养物以1×105个细胞/孔接种到6孔板中。然后将适当体积的载体上清液添加到pcl中(在4-8μg/ml聚凝胺存在下)，对应于0.1、0.5、5、25和125的m.o.t.。在20-24小时后，用2ml新鲜培养基替换载体上清液。为了提高m.o.t.，可以在第二天使用相同体积的载体上清液重复转导过程。如上所述，生产细胞汇集物生长至汇合，在汇合后24、48和72小时使用每日新鲜培养基再进料计划每天收集上清液，以确定pcr转导滴度和/或使用cd4阳性细胞系评估基因表达的转移。使用有限稀释接种将选择的非克隆汇集物克隆到96孔板中，实现每个孔单个细胞，随着单个克隆组的扩增，使用几轮滴度测定和表达转移测定对其进行分析。具有可持续高滴度生产特性的vpcl克隆被冷冻保存，以制备经过安全测试(无菌性、支原体、具有复制能力的逆转录病毒以及其他病毒外来剂，如fda的考虑要点出版物中所述)的冷冻下来的工作储备物。作为合格细胞库储备物表征的一部分，还对源自单个克隆的病毒颗粒进行病毒基因组测序以确保基因组mlv序列的准确性。一旦合格，可对来自合格细胞库储备物的小瓶进行进一步扩增，并在gmp下进行进一步测试，以生产gmp master细胞库和工作细胞库储备物，用于最终的临床生产。实施例10[0198]用mirna使b淋巴瘤细胞去靶向化以防止肿瘤细胞中的载体表达(gfp)的体内测试[0199]分化的细胞类型表达独特的mirna集合，即小的非编码rna，它们通过降解其靶mrna而作为基因表达的转录后调节子。将特异性mirna序列添加到非复制型逆转录病毒的转录物中会导致细胞类型特异性的逆转录病毒降解，从而可以在不期望逆转录病毒转导和表达的细胞中有效地关闭逆转录病毒。为了证明这种方法的有效性，使用慢病毒载体将ht1080人纤维肉瘤细胞工程化改造为过表达它通常不表达的mirna r223-3p。然后用由质粒pba-9b-gfp(c45)和pba-9b-gfpmir 223-3p4tx(c7)制成的gfp载体挑战这些细胞，并得到结果。在表达mir223-3p的ht1080细胞中，来自gfp-mirt223-3p载体的gfp表达几乎完全关闭，但在有或没有mir223-3p表达的细胞中使用未修饰的gfp，gfp的表达水平相当。为了在较少工程化改造的情况下显示这种效果，单核细胞系u937显示出表达来自未修饰的载体或来自具有不相关mirna靶标(663a-t)的载体的gfp，而不表达来自具有mir223-3p的载体的gfp(图10)。这些实验显示了使用mirt修饰的载体在表达匹配的microrna的特定细胞类型中关闭基因表达的能力。编码ires cd模块的载体也证明了这种能力，表明杀伤开关基因(ires-杀伤开关，该情况下是胞嘧啶脱氨酶)的构造同样适用于这种类型的表达控制。总之，这些数据证实可以利用转导细胞表达的mirna序列来消除rnv有效载荷(payload)的表达。实施例11[0200]在同基因小鼠淋巴瘤模型中直接施用编码抗小鼠cd19 car的rnv的体内治疗效果[0201]质粒pba-9b-mcd19(1d3)-iresycd(c40)编码具有ires-cd盒的wo 2020/142780中描述的抗小鼠cd19(id3)car载体，并被用于粒制备如实施例2至6中所述的感染性载体。[0202]使用balb/c小鼠中的a20淋巴瘤细胞系(荧光素化的)(kueberuwa等，j.vis.exp.,(140),e58492,2018)作为模型来评估小鼠抗cd19 car构建体(mcd19-rnvcar，mcd19(1d3)-ires ycd(v))的体内感染效力，该小鼠抗cd19 car构建体包含：小鼠抗cd19 scfv 1d3，之后是鼠cds跨膜结构域，之后是鼠4-1bb胞内结构域，之后是鼠cd3i(构建体4)细胞内结构域。简而言之，在植入a20淋巴瘤细胞的前一天，向6至8周龄的balb/c小鼠的腹膜中施用(ip)150mg/kg环磷酰胺。环磷酰胺预处理允许稳健的a20肿瘤植入。在第0天，iv注射a20 b细胞淋巴瘤细胞(200μl中1e5个细胞)。载体mcd19(1d3)-ires ycd(v)以每天1e8 tu的剂量连续注射4天，在a20植入后第3天开始。[0203]通过对a20淋巴瘤细胞发光信号的评估，到第25天，与载体处理的对照相比，mcd19(1d3)-ires ycd(v)处理导致a20肿瘤负荷降低(参见图7)。数值辐射亮度的显著降低在视觉上也很明显(参见图7c，处理组与对照组相比有明显的生存优势，其中4/10对照组肿瘤存活者中没有检测不到肿瘤的动物，6/10处理组肿瘤存活者中有2只检测不到肿瘤的动物)。a20肿瘤负荷的减少表明，iv注射施用mcd19-rnvcar载体可抑制a20肿瘤生长。为了在静脉注射施用mcd19(1d3)-ires ycd(v)后发生肿瘤生长抑制，载体必须进入循环的t细胞，mcd19-car必须在这些t细胞的表面上表达，然后这些t细胞必须回到播散性肿瘤的位点，最后，t细胞表面上的mcd19-car必须与a20肿瘤细胞上的cd19结合并激活对a20肿瘤细胞的杀伤。实施例12[0204]通过使用前药激活基因来去激活car-t细胞[0205]a.用cd基因加5-fc和tk基因加更昔洛韦体外杀死感染细胞，参见图9和图例。[0206]b.使用酵母胞嘧啶脱氨酶(cd)杀伤开关体外灭活car-t细胞，该杀伤开关将前药氟胞嘧啶转化为5-fu，缓解急性细胞因子释放综合征(crs)并减轻体外长期b细胞缺失。[0207]测量胞嘧啶脱氨酶活性和杀死细胞的能力的体外和体内测定法描述于美国专利公开(告)号us20140178340a1和us9732326b2中。在该实施方式中，cd用作杀伤开关以消除rnv转导的cd19 car阳性细胞，从而结束cd19car活性的治疗处理。急性crs和长期b细胞发育不全都可以通过部署内置于cd19 car载体(例如构建体8和11)中的酵母cd杀伤开关来缓解。可以通过美国专利号9,732,326b2中描述的体外测定法和用酵母cd+载体(构建体8)转导的细胞与cd-载体(构建体14)转导的细胞相比较的5-fc杀伤曲线，来确认具有胞嘧啶脱氨酶(被工程化改造以在cd19car rnv中表达)的多肽的表达和活性。这些数据显示，与cd-细胞相比，cd+细胞对5fc的敏感性提高了近100倍。[0208]在另一个实施方式中，具有胞嘧啶脱氨酶的多肽被替换为优化的胸苷激酶(tko)作为杀伤开关。tko的序列、用于测量胸苷激酶活性和细胞杀伤能力的体外和体内测定法均描述于美国专利公开号us20150273029a1中。与胞嘧啶脱氨酶类似，当被添加到含有额外治疗基因的rnv中时，使用tko可以通过原位磷酸化激活常见的抗疱疹药物(例如更昔洛韦、阿昔洛韦、伐昔洛韦(valtrextm)或其他类似物)，从而导致rnv转导细胞和邻近细胞的细胞杀伤。因此，急性crs和长期b细胞发育不全均可以通过在与抗疱疹药物组合使用时部署内置到cd19 car载体中的tko杀伤开关来缓解。[0209]人类中cd19car治疗的急性副作用与car-t功能产生的某些细胞因子水平较高有关，即细胞因子释放综合征(crs)。这种副作用可能导致住院时间延长，并可能危及生命。通过减少car-t细胞数量而不完全消除反应来降低car-t细胞功能介导的细胞因子反应的能力可以提高安全性以及减少与传统car-t相关的副作用。为了评估杀伤开关降低crs的能力，cd34+移植的小鼠用cd19car(v)或cd19car-ycd(v)进行iv处理，两天后向其施用50至500mg/kg的各种浓度的5-氟胞嘧啶。在没有氟胞嘧啶的情况下，约30％的小鼠发展出crs样症状，并表现出血液细胞因子(il-6、ifn-g、gm-csf和tnfa)浓度的升高。通过pcr和流式细胞术，那些显示细胞因子水平升高的小鼠也显示出cd19car在脾脏和骨髓中的强持久性。在高剂量的氟胞嘧啶(500mg/kg)情况下，用cd19car-ycd(v)处理的小鼠均未表现出外周血细胞因子升高或cd19car在脾脏和骨髓中的持续存在，而在用cd19car(v)处理的小鼠中出现crs样症状的小鼠百分比保持不变。这表明细胞因子升高和crs样症状与cd19car的存在有关。然而，在低剂量的氟胞嘧啶(50-150mg/kg)情况下，用cd19car-ycd(v)处理的小鼠均未表现出细胞因子升高或crs样症状，而cd19car(v)中的crs影响仍为30％。在用cd19car-ycd(v)处理的动物中，仍然存在可检测到的cd19car和持续性b细胞发育不全，这表明低剂量的前药可以降低与car功能相关的细胞因子水平，而不会消除car和car功能。用低剂量前药调节或调整细胞因子反应的能力开启了在不破坏cd19car-ycd(v)转导t细胞功能的情况下提高安全性的可能性。[0210]c.使用tko杀伤开关体内失活car-t细胞，减轻长期b细胞发育不全效应和急性细胞因子释放综合征(crs)。[0211]在另一个实施方式中，在表达cd19car的rnv中用tko替代酵母胞嘧啶脱氨酶(ycd)。通过部署内置于cd19 car载体中的tko杀伤开关，可以减轻与car-t活性相关的长期b细胞发育不全效应和急性crs效应。如上文所述进行类似的体内研究，结果相似：用低浓度的前药(例如5-20mg/kg更昔洛韦，ip，每天两次)激活tko杀伤开关可减少与crs相关的外周细胞因子，同时允许cd19car转导的t细胞持续杀死肿瘤细胞；并且，用高剂量前药(例如50mg/kg更昔洛韦，ip，每天两次)激活tko杀伤开关可有效消除car转导细胞和car转导细胞的活性，即b细胞耗竭。实施例13a[0212]在非复制型逆转录病毒载体(也表达靶向cd19的嵌合抗原受体)中表达il-12p70的体外测试[0213]将人il-12p70作为单链构建体添加到表达人car的构建体中(构建体16；seq id no：3)，这支持car的持续和有效的t细胞活性，并促进非car转导的免疫细胞的抗癌免疫活性。用编码人cd19靶向car或编码共表达il-12p70转基因的cd19靶向car(pba9b-cd19car，构建体6或8，以及pbab-cd19car-il-12p70，构建体16)的rnv，以不同moi(例如0.1、1和10)转导原代外周t细胞或t细胞系(例如tall-104，jurkat)。对转导细胞样品进行蛋白质印迹，确认cd19 car和构建体16的剂量依赖性表达，对应于所用moi增加的il-12p70蛋白水平的增加。用增殖监测染料(例如celltrace violet)标记rnv转导的细胞。然后在体外培养实验中，将该细胞与表达cd19的细胞(例如nalm-6+/-cd19表达，原代b细胞，或重组表达cd19的修饰细胞)混合。从混合细胞反应中取出时间进程中的2、6、12、24和48小时的培养基和细胞。例如，使用nalm6-cd19wt和nalm6-cd19ko肿瘤细胞系，收集共培养上清液，使用酶联免疫吸附测定(elisa)和基于流式细胞术的biolegend的legendplextm测定法来测量分泌的细胞因子水平。重编程的car-t细胞以car特异性的方式仅在有nalm6-cd19wt而不是有nalm6-cd19ko的培养物的上清液中分泌细胞因子，例如il2、ifng和tnf。elisa证实，当il-12p70由cd19car rnv共表达时，所有moi情况下干扰素γ的产生都增加。在较低的moi情况下观察到干扰素γ产生的最大差异。[0214]对样品进行流式细胞术以测量t细胞增殖以及细胞杀伤。在所有三种构建体中，观察到伴随moi增加的剂量依赖性的细胞增殖的增加。此外，当il-12p70由cd19car rnv共表达时，与仅表达cd19 car相比，该转导细胞显示出在同一时间范围内发生的细胞分裂数量的增加。使用类似于gfpmirt的方法，观察到细胞杀伤和和对应于t细胞分裂的细胞杀伤增加的类似效果。实施例13b[0215]在另一个实施方式中，在表达cd19car的rnv中，用il-2替代il12p70(构建体14；seq id no：5)。如上文所述进行类似的体外研究，结果相似。蛋白质印迹和elisa证实，il-2与cd19 car一起在转导细胞中表达。在测定中，当il-2与cd19 car在rnv转导的t细胞中共表达时，这些t细胞表现出增加的活性(增殖)、cd19激活后的细胞因子分泌(干扰素γ)以及增加的转导t细胞对cd19表达细胞的杀伤。实施例13c[0216]在另一个实施方式中，在表达cd19car的rnv中，用il-242a代替il12p70(il-2supmut，构建体13；seq id no：6)。如上文所述进行类似的体外研究，结果相似。蛋白质印迹和elisa证实，il-2supmut与cd19 car一起在转导细胞中表达。当il-2supmut与cd19 car在rnv转导的t细胞中共表达时，这些t细胞表现出增加的活性(增殖)、cd19激活后的细胞因子分泌(干扰素γ)以及增加的转导t细胞对cd19表达细胞的杀伤。此外，进行了体外研究，比较与用构建体6、8、13或14转导的treg细胞(原代或mt-2细胞系)1:1混合的t细胞系。用构建体6、8和14转导的细胞显示对treg的激活和il-10的表达，而用il-2supmut转导的那些细胞显示与基线相当的水平，这证实使用il-2supmut增加了cd19car+th1 cd4+和cd8+ t细胞的活性，同时排除了在同一培养物中的treg群体活性的增强。实施例13d[0217]在另一个实施方式中，在表达cd19car的rnv中，用il-7r-cpt代替il12p70(构建体15；seq id no：4)。白细胞介素7受体α亚基(il7ra)又称为cd抗原cd127，属于i型细胞因子受体家族和4型亚家族。il7ra/cd127在各种细胞类型上表达，包括幼稚t细胞和记忆t细胞以及许多其他细胞。il7ra与白细胞介素2受体γ亚基(il2rg)形成异二聚体以传递il7信号。然而，il7ra可以获得半胱氨酸和/或非半胱氨酸突变以形成同二聚体，导致配体(il7)非依赖性信号事件。这种不依赖配体的il7ra同二聚体(il7-ra-cpt)支持t细胞的持续增殖和长期持续存在。如上文所述进行类似的体外研究，结果相似。蛋白质印迹和elisa证实，il-7ra-cpt与cd19 car一起在转导细胞中表达。与上述测定类似地，当il-7r-cpt与cd19 car在rnv转导的t细胞中共表达时，这些t细胞表现出增加的活性(增殖)、cd19激活后的细胞因子分泌(干扰素γ)以及增加的转导t细胞对cd19表达细胞的杀伤。实施例13e[0218]在另一个实施方式中，在表达cd19car的rnv中，用il-12或与il-12p70不相关的il-12衍生物替代il12p70(构建体16)。如上文所述进行类似的体外研究，结果相似。蛋白质印迹和elisa证实，il-12与cd19 car一起在转导细胞中表达。与上述测定类似地，当il-12与cd19 car在rnv转导的t细胞中共表达时，这些t细胞表现出增加的活性(增殖)、cd19激活后的细胞因子分泌(干扰素γ)以及增加的转导t细胞对cd19表达细胞的杀伤。实施例13f[0219]在另一个实施方式中，在表达cd19car的rnv中，用cjun替代il12p70(构建体12；seq id no：7)。c-jun的表达支持细胞增殖，而过表达则加速细胞增殖。t细胞功能障碍或耗尽与c-jun水平降低有关，c-jun的过度表达恢复t效应物功能，同时支持持续的细胞周期进程和长期持续存在。蛋白质印迹证实cjun与cd19 car一起在转导细胞中表达。与上述进行的测定类似地，当cjun与cd19 car在rnv转导的t细胞中共表达时，这些t细胞表现出增加的活性(增殖)和存活率、cd19结合激活后的细胞因子分泌(干扰素γ)，以及增加的转导t细胞对cd19表达细胞的杀伤。通过在与cd19阳性细胞共培养之后将时间过程延长至10天并与使用构建体6没有cjun表达的结果进行比较来确定增加的存活。实施例13g[0220]在另一个实施方式中，在表达cd19 car的rnv中，用il-15替代il12p70(构建体9或10)。il-15是一种刺激cd8 t细胞和自然杀伤(nk)的细胞活化、增殖和细胞溶解活性的细胞因子。在没有抗原的情况下由il-15提供维持记忆t细胞的存活信号，可能有助于产生持久的car t反应。如上文所述进行类似的体外研究，结果相似。当il-15与cd19 car在rnv转导的t细胞中共表达时，这些t细胞表现出增加的活性(增殖)、cd19激活后的细胞因子分泌(il2、ifng和tnf)，以及增加的转导t细胞对cd19表达细胞的杀伤。其他体外研究表明，il-15表达有助于培养物中的持久记忆t细胞汇集物。实施例13h[0221]在非复制型逆转录病毒载体(也表达靶向cd19的嵌合抗原受体)中表达反向转录的il-15的体外测试。在rnv骨架中加入经工程化改造以相对于cd19 car基因的相反方向转录的il-15基因(构建体9；seq id no：15)，这允许该il-15基因相对于与cd19 car同方向转录的il-15转基因(构建体10；seq id no：8)的表达增加。car表达构建体支持car的持续的和有效的t细胞活性，并促进非car转导免疫细胞的抗癌免疫活性。用编码cd19靶向car(pba9b-cd19car)或编码在任一方向的共表达il-15转基因的cd19靶向car(pbab-cd19car-il-15，构建体9或10)的rnv，以不同moi(例如0.1、1和10)转导原代外周t细胞或t细胞系(例如tall-104；jurkat)。对转导细胞样品进行蛋白质印迹，确认cd19 car和构建体9的剂量依赖性表达，对应于所用moi增加的il-15蛋白水平的增加，以及使用相对于cd19car转基因的反方向时的表达增加。用增殖监测染料(例如celltrace violet)标记rnv转导的细胞。然后在体外培养实验中，将该细胞与表达cd19的细胞(例如nalm-6；原代b细胞或重组表达cd19的修饰细胞)混合。从混合细胞反应中取出时间进程中的2、6、12、24和48小时的培养基和细胞。与上述进行的测定类似地，elisa证实，当il-12p70由cd19car rnv共表达时，所有moi情况下干扰素γ的产生都增加。实施例13i[0222]在其他实施方式中，可以将其他免疫调节物工程化改造为以反方向转录以增加转基因的表达。如实施例13a-f中所述的il2、il2supmut、il12p70细胞因子、il-7ra-cpt和cjun均可用于代替il-15。实施例13j[0223]在其他实施方式中，pba-9b rnv骨架可以用自失活(sin)ltr替代(构建体27；seq id no：18)。由于rnv ltr启动子活性的破坏，使用替代启动子。无内含子的ef1a或cmv启动子可用于表达来自psin-rnv的转基因。在本实施例中，由rnv中编码的ef1a启动子表达人或小鼠cd19car，同时还编码ires或2a序列以表达杀伤开关(例如酵母胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或它们的突变体)(构建体27)。此外，可以由杀伤开关下游的cmv启动子表达附加的转基因。在构建体27和29中，由cmv启动子表达il-15细胞因子。cmv启动子和il-15基因可被放置于相对于cd19car的转录方向的两个方向上(构建体9和10)。采用类似的如上所述的研究表征这些构建体中所有转基因的表达和活性。实施例13k[0224]在其他实施方式中，pba-9b rnv骨架可以用自失活(sin)慢病毒骨架替代(构建体28；seq id no：19)。如本文所述，可以使用包括car、ires-杀伤开关、免疫调节物、mirna靶序列、shrna和启动子在内的所有设计的转基因。除了rnv序列(不包括rnv ltr和包装序列)，使用土拨鼠转录后调控元件来增强转基因的表达(zufferey等，“woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors,”journal of virology,73(4):2886-2892,1999)。将与本文描述的相同的用于表征转基因表达和活性的体外和体内测定法用于这种非复制型sin慢病毒载体。实施例13l[0225]sirna构建体。本公开的非复制型逆转录病毒载体可用于调节免疫细胞的活性，表达工程化改造的sirna、shrna或mirna，其关闭或降低控制细胞(包括免疫细胞)活性的关键基因的表达。此类靶标包括诸如pd-1的基因，pd-1是调节t细胞活性的中心检查点和阻止或降低抗癌活性的关键蛋白。美国专利us20150273029a1中描述了测量shrna-pd-1表达和转录物敲低能力的体外和体内测定法。为了证明在moi为10的情况下用构建体19载体感染的原代t细胞中pd-1的有效敲低，由感染后第3天收获的t细胞提取总rna。通过qrt-pcr测量pd-1的基因表达，使用rna poliii启动子转录物作为标准化的内部参照。使用δδc(t)方法计算pd-1相对幼稚原代t细胞的相对表达水平。数据显示，在感染后第3天，超过70％的pd-1被下调。感染的细胞在il-2存在下培养至多10天，观察到pd-1的持续敲低。同时，使用上述方法和实验对类似转导的原代t细胞进行cd19car活性的表征。72小时的xcelligence检测显示，相对于单独的cd19car，当pd-1shrna与cd19car组合表达时显示出对nalm6-cd19wt肿瘤细胞系的car特异性杀伤和生长抑制的加倍。实施例14[0226]在非复制型逆转录病毒载体(也表达靶向cd19的嵌合抗原受体)中表达il-12p70的体内测试[0227]il-12由两个亚基il-12a(p35)和il-12b(p40)组成，形成异二聚体活性细胞因子il-12p70。il-12p70由抗原呈递细胞(包括树突状细胞和巨噬细胞)响应抗原刺激而自然产生。il-12p70是促炎细胞因子，可以增强nk细胞和t细胞的ifng产生和细胞毒性效应功能，促进cd4 t细胞中的th1表型和adcc活性，并作为树突状细胞和巨噬细胞的化学引诱物。所有这些il-12活性可以刺激宿主抗肿瘤活性。将il-12p70作为单链构建体添加到表达car的构建体中(构建体16)，这支持car的持续和有效的t细胞活性，并促进非car转导免疫细胞的抗癌免疫活性。[0228]通过向8周龄的nsg小鼠(静脉内植入了萤光素化的nalm6急性淋巴细胞白血病细胞和人pbmc)静脉内注射重组逆转录病毒载体(pba9b-cd19car，构建体6或8，和pbab-cd19car-il-12p70，构建体16(人car，il12)[构建体41是小鼠cd19car;il12])，体内测试由表达cd19靶向car的相同病毒载体表达的il-12p70的功能效应。通过静脉内注射将1e6至5e8 tu剂量的每种载体储备物或载体对照施用给每个处理组，用于疗效评估(肿瘤负荷和存活)的处理组每组10只动物，用于免疫评估(流式细胞术)的处理组每组5只动物。在研究期间通过荧光素酶信号的周期性成像测量肿瘤负荷。评估对照和处理动物的存活。结果表明，与对照处理的动物相比，用表达cd19 car(构建体6)的病毒载体进行处理降低了肿瘤负荷(通过荧光素酶信号测量)，延长了存活。与对照和cd19car(构建体6)处理的动物相比，cd19car-il-12p7(构建体16)减少了肿瘤负荷(通过荧光素酶信号测量)，延长了存活，并导致在某些情况下完全没有可检测到的肿瘤。在处理开始后不久对受nalm6影响的淋巴结进行流式细胞术分析。结果显示与cd19car(构建体6)相比，用cd19car-il-12p70(构建体16)处理的动物中t细胞的活化和脱粒均增强。[0229]通过向有免疫能力的8周龄balb/c小鼠(静脉内植入了荧光素化的a20 b细胞淋巴瘤细胞)静脉内注射重组逆转录病毒载体(pba9b-mcd19car，构建体40，seq id no：16)和pbab-mcd19car-il-12p70，构建体体41，seq id no：13)，体内测试由表达cd19靶向car的相同病毒载体表达的il-12p70的功能效应。通过静脉内注射将1e6至5e8 tu剂量的每种载体储备物或载体对照施用给每个处理组，用于疗效评估(肿瘤负荷和存活)的处理组每组10只动物，用于免疫评估(流式细胞术)的处理组每组5只动物。在研究期间通过荧光素酶信号的周期性成像测量肿瘤负荷。评估对照和处理动物的存活。结果表明，与对照处理的动物相比，用表达mcd19car(构建体40)的病毒载体进行处理降低了肿瘤负荷(通过荧光素酶信号测量)，延长了存活。与对照处理动物相比，mcd19car-il-12p70(构建体41；seq id no：13)降低了肿瘤负荷(通过荧光素酶信号测量)，延长了存活，并导致在某些情况下完全没有可检测到的肿瘤。在处理开始后不久对受a20影响的淋巴结进行流式细胞术分析。结果显示与mcd19car(构建体40)相比，用mcd19car-il-12p70(构建体41)处理的动物中t细胞活化和脱粒均增强。此外，经mcd19car-il-12p70处理且未检测到肿瘤的动物能够抵抗a20细胞的再次挑战而不需要任何额外的处理。与抵抗再次挑战相关的免疫记忆与mcd19car-il-12p70转导的t细胞的持续存在部分相关，但也与免疫学习(与增强的炎症和il-12p70表达介导的抗原呈递激活有关)相关。在再次挑战前，通过用氟胞嘧啶激活cd杀伤开关(存在于pba9b-mcd19car和pbab-cd19car-il-12p70病毒载体中)杀死表达car的细胞，证实了免疫学习的贡献。在氟胞嘧啶ip施用并确认完全不存在表达cd19car-il-12p70的细胞后，存活的治愈的a20动物对a20的再次挑战具有抗性。实施例15[0230]在非复制型逆转录病毒载体(也表达靶向cd19的嵌合抗原受体)中表达il-2f42a的体内测试[0231]在另一个实施方式中，用il-2(构建体42；seq id no：14)分别替代表达人和小鼠cd19car的rnv构建体14和42中的il12p70。il-2是高炎症性的，在外周发挥作用，促进幼稚t细胞分化为效应t细胞和记忆t细胞。il-2由活化的cd4+t细胞和cd8+t细胞自然产生。已经证明il-2在多种情况下具有抗肿瘤活性，但il-2的全身给药与严重的副作用相关。野生型il-2还作用于treg细胞以抑制免疫反应。将不作用于treg细胞的il-2f42a添加到表达car的构建体中，这支持car的持续和有效的t细胞活性，并促进非car转导免疫细胞的抗癌免疫活性。此外，表达car的t细胞向该特定car的高抗原密度肿瘤部位自然归巢的能力将il-2的表达主要限制在肿瘤内。[0232]如上文所述进行类似的体内研究，结果相似。结果显示与cd19car相比，在用cd19car-il-2f42a(v)(构建体42)处理的植入有pbmc的nalm6荷瘤nsg小鼠中，t细胞的活化和脱粒增强，t细胞数量增加。在有免疫能力的a20荷瘤动物中，结果显示与mcd19car相比，在用mcd19car-il-2f42a处理的小鼠中t细胞的活化和脱粒增强，t细胞增加。用mcd19car-il-2f42a(v)处理有免疫能力的a20荷瘤小鼠(而不是用单独的mcd19car(v)处理该小鼠或者对照处理的动物)也导致完全治愈和本文所述的免疫学习。实施例16[0233]在非复制型逆转录病毒载体(也表达靶向cd19的嵌合抗原受体)中表达il-15-il-15ra的体内测试[0234]在另一个实施方式中，在表达人和小鼠cd19car的rnv中，用il-15-il-15ra(构建体49和54)替代il12p70。il-15主要由树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞表达并支持t细胞和nk细胞的活化、增殖和存活。il-15以与il15ra受体复合的膜结合形式存在。这种有效的信号复合物可以通过与il-15ra的sushi结构域连接的il-15(il-15-il15ra)的单链表达以可溶形式被重现。将分泌的il-15-il-15ra作为单链构建体添加到表达car的构建体中，这支持car的持续和有效的t细胞活性、car和非car t细胞向长寿命记忆t细胞的分化，以及非car转导免疫细胞的抗癌免疫活性。[0235]按照上文所述地进行类似体外研究，结果相似。结果显示与cd19car相比，在用cd19car-il-15-il-15ra(v)(构建体49)处理的植入有pbmc的nalm6荷瘤nsg小鼠中，t细胞的活化和脱粒增强。在有免疫能力的a20荷瘤动物中，结果显示与mcd19car相比，用mcd19car-il-15-il-15ra(v)处理的小鼠中t细胞活化和脱粒增强。用mcd19car-il-2f42a(v)处理有免疫能力的a20荷瘤小鼠，而不是单独的mcd19car(v)或对照处理的动物，也导致完全治愈和上述类似的免疫学习。实施例17[0236]在非复制型逆转录病毒载体(也表达靶向cd19的嵌合抗原受体)中表达白介素7受体α突变体的体内测试[0237]在另一个实施方式中，在表达cd19car的rnv中，用il-7ra-cpt替代il12p70(构建体15和55-人和小鼠cd19car)。白细胞介素7受体α亚基(il7ra)也被称为cd抗原cd127，属于i型细胞因子受体家族和4型亚家族。il7ra/cd127在各种细胞类型上表达，包括幼稚t细胞和记忆t细胞以及许多其他细胞。il7ra与白细胞介素2受体亚基γ(il2rg)形成异二聚体以传递il7信号。然而，il7ra可以获得半胱氨酸和/或非半胱氨酸突变以形成同二聚体，导致不依赖配体(il7)的信号事件。这种不依赖配体的il7ra同二聚体支持t细胞的持续增殖和长期持续存在。将突变的il7ra构建体添加到表达car的构建体中(构建体15)，这支持持续的增殖、持续存在和效力，同时促进体内重编程t细胞的抗癌免疫活性。[0238]按照上文所述地进行类似体外研究，结果相似。结果显示与cd19car相比，在用cd19car-il-7ra-cpt(构建体15)处理的植入有pbmc的nalm6荷瘤nsg小鼠中，t细胞的活化和脱粒增强，t细胞数量增加。在有免疫能力的a20荷瘤动物中，结果显示与mcd19car相比，用mcd19car-il-7ra-cpt(构建体55)处理的小鼠中t细胞活化和脱粒增强，t细胞增加。用mcd19car-il-7ra-cpt(v)处理有免疫能力的a20荷瘤小鼠，而不是单独的mcd19car(v)或对照处理的动物，也导致完全治愈和上述类似的免疫学习。实施例18[0239]在非复制型逆转录病毒载体(也表达靶向cd19的嵌合抗原受体)中表达c-jun的体内测试[0240]在另一个实施方式中，在表达人和小鼠cd19car的rnv中，用c-jun替代il12p70(构建体12；seq id no：7)。c-jun是由jun基因编码的蛋白质。c-jun与c-fos结合形成ap-1早期反应转录因子。c-jun转录由它自己的产物自动调节，因此它延长了它的来自胞外刺激的信号。c-jun的表达支持细胞增殖，而过表达则加速细胞增殖。t细胞的功能障碍或衰竭与c-jun水平降低有关，它的过表达可恢复t效应物功能，同时支持持续的细胞周期进程和长期持续存在。将c-jun构建体添加到表达car的构建体中(构建体xx)，这支持效应子功能、持续增殖、持久性和效力，同时促进体内重编程t细胞的抗癌免疫活性、持续增殖、持久性和效力，同时促进体内重编程t细胞的抗癌免疫活性。[0241]按照上文所述地进行类似体外研究，结果相似。结果显示与cd19car相比，用cd19car-c-jun处理的植入有pbmc的nalm6荷瘤nsg小鼠中，t细胞的活化和脱粒增强，t细胞数量增加。在有免疫能力的a20荷瘤动物中，结果显示与mcd19car相比，用mcd19car-c-jun处理的小鼠中t细胞的活化和脱粒增强，t细胞增加。用mcd19car-c-jun(v)处理有免疫能力的a20荷瘤小鼠，而不是单独的mcd19car(v)或对照处理的动物，也导致完全治愈和上述类似的免疫学习。实施例19[0242]在非复制型逆转录病毒载体(也表达靶向cd19的嵌合抗原受体)中表达针对检查点抑制剂pd-1的短发夹rna(shpd-1)的体内测试[0243]在另一个实施方式中，在表达cd19car的rnv中，用针对检查点抑制剂pd-1的短发夹rna替代il12p70(构建体19；seq id no：9)。pd-1由t细胞在激活后表达，是t细胞衰竭的指示物。pd-1抑制t细胞炎症活性并促进t细胞凋亡。可以通过阻断pd-1活性逆转t细胞的功能障碍或衰竭。通过支持t细胞杀死癌细胞，用治疗性抗体阻断pd-1检查点已在某些癌症适应症中显示出临床疗效。将shpd-1添加到表达car的构建体中(构建体19)，这支持表达car的t细胞的持续活性，包括存活、增殖和癌细胞杀伤。[0244]按照上文所述地进行类似体外研究，结果相似。结果显示与cd19car相比，用cd19car-shpd-1(构建体19)处理的植入有pbmc的nalm6荷瘤nsg小鼠中，t细胞的活化和脱粒增强，t细胞数量增加。在有免疫能力的a20荷瘤动物中，结果显示与mcd19car(构建体40；seq id no：16)相比，用mcd19car-shpd-1(构建体m-shpd-1)处理的小鼠中t细胞的活化和脱粒增强，t细胞增加。用mcd19car-shpd-1(v)处理有免疫能力的a20荷瘤小鼠，而不是单独的mcd19car(v)或对照处理的动物，也导致完全治愈和上述类似的免疫学习。实施例20[0245]bcma是一种成熟浆细胞标志物，在别处表达最少，已在多发性骨髓瘤治疗中成功用作car的识别靶标(kochenderfer jn.等，n engl j med.,380(18):1726-1732,2019年5月2日)。使用抗bcma car展示体内car递送系统对cd19以外的抗原的功效。[0246]构建和体外测试具有自杀基因和对b细胞和单核细胞去靶向的mirna靶标的a-bcma car载体[0247]载体的结构与抗cd19 car一样，但替换了已知的抗bcma car序列(例如仅vh人源化的fhvh33-cd8bbz(lam等，nature communic.,2020))以制备pba-9b-bcmacar1.fhvh33-cd8bbz.mirt663a-223。[0248]相应的密码子优化的dna核酸序列是：atggccctgcccgtgaccgccctgctgctgcccctggccctgctgctgcacgccgccaggcccgaggtgcagctgctggagagcggcggcggcctggtgcagcccggcggcagcctgaggctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgagctgggtgaggcaggcccccggcaagggcctggagtgggtgagcagcatcagcggcagcggcgactacatctactacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacatcagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaaggagggcaccggcgccaacagcagcctggccgactacaggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcttcgtgcccgtgttcctgcccgccaagcccaccaccacccccgcccccaggccccccacccccgcccccaccatcgccagccagcccctgagcctgaggcccgaggcctgcaggcccgccgccggcggcgccgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgcgacatctacatctgggcccccctggccggcacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtgatcaccctgtactgcaaccacaggaacaagaggggcaggaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcagaccacccaggaggaggacggctgcagctgcaggttccccgaggaggaggagggcggctgcgagctgagggtgaagttcagcaggagcgccgacgcccccgcctaccagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcaggagggaggagtacgacgtgctggacaagaggaggggcagggaccccgagatgggcggcaagcccaggaggaagaacccccaggagggcctgtacaacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagaggaggaggggcaagggccacgacggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccagg；或者(sid50)与wo2015/158671中的car肽对应的密码子优化的dna核酸序列，以制备pba-9b-bcmacar2.sid50.mirt663a-223atggccctgcccgtgaccgccctgctgctgcccctggccctgctgctgcacgccgccagaccccaggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagcccggcgccagcgtgaaggtgagctgcaaggccagcggctacagcttccccgactactacatcaactgggtgagacaggcccccggccagggcctggagtggatgggctggatctacttcgccagcggcaacagcgagtacaaccagaagttcaccggcagagtgaccatgaccagagacaccagcatcaacaccgcctacatggagctgagcagcctgaccagcgaggacaccgccgtgtacttctgcgccagcctgtacgactacgactggtacttcgacgtgtggggccagggcaccatggtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgacatcgtgatgacccagacccccctgagcctgagcgtgacccccggccagcccgccagcatcagctgctggagcagccagagcctggtgcacagcaacggcaacacctacctgcactggtacctgcagaagcccggccagagcccccagctgctgatctacaaggtgagcaacagattcagcggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagcagagtggaggccgaggacgtgggcatctactactgcagccagagcagcatctacccctggaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagaccaccacccccgcccccagaccccccacccccgcccccaccatcgccagccagcccctgagcctgagacccgaggcctgcagacccgccgccggcggcgccgtgcacaccagaggcctggacttcgcctgcgacatctacatctgggcccccctggccggcacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtgatcaccctgtactgcaagagaggcagaaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacccaggaggaggacggctgcagctgcagattccccgaggaggaggagggcggctgcgagctgagagtgaagttcagcagaagcgccgacgcccccgcctaccagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagagaggagtacgacgtgctggacaagagaagaggcagagaccccgagatgggcggcaagcccagaagaaagaacccccaggagggcctgtacaacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagagaagaagaggcaagggccacgacggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccaga；或者(sid56)与wo2015/158671中的car肽对应的密码子优化的dna核酸序列，以制备pba-9b-bcmacar3.sid 56.mirt663a-223atggccctgcccgtgaccgccctgctgctgcccctggccctgctgctgcacgccgccagaccccaggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagcccggcgccagcgtgaaggtgagctgcaaggccagcggctacagcttccccgactactacatcaactgggtgagacaggcccccggccagggcctggagtggatgggctggatctacttcgccagcggcaacagcgagtacaaccagaagttcaccggcagagtgaccatgaccagagacaccagcatcaacaccgcctacatggagctgagcagcctgaccagcgaggacaccgccgtgtacttctgcgccagcctgtacgactacgactggtacttcgacgtgtggggccagggcaccatggtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgacatcgtgatgacccagacccccctgagcctgagcgtgacccccggccagcccgccagcatcagctgctggagcagccagagcctggtgcacagcaacggcaacacctacctgcactggtacctgcagaagcccggccagagcccccagctgctgatctacaaggtgagcaacagattcagcggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagcagagtggaggccgaggacgtgggcatctactactgcagccagagcagcatctacccctggaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagaccaccacccccgcccccagaccccccacccccgcccccaccatcgccagccagcccctgagcctgagacccgaggcctgcagacccgccgccggcggcgccgtgcacaccagaggcctggacttcgcctgcgacatctacatctgggcccccctggccggcacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtgatcaccctgtactgcaagagaggcagaaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacccaggaggaggacggctgcagctgcagattccccgaggaggaggagggcggctgcgagctgagagtgaagttcagcagaagcgccgacgcccccgcctaccagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagagaggagtacgacgtgctggacaagagaagaggcagagaccccgagatgggcggcaagcccagaagaaagaacccccaggagggcctgtacaacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagagaagaagaggcaagggccacgacggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccaga。所得质粒用于产生相应的感染性rnv制剂。如下所述，使用感染性载体在体外和体内测试car的活性。[0249]体外测试[0250]如本文所述，第一car t细胞通过在适当的t细胞刺激下转导pbmc而在体外产生。对转导的细胞进行表征，产生20-80％的t细胞转导。然后使用这些细胞进行体外测试。[0251]脱粒测定(cd107a动员)[0252]t细胞在96孔板(40,000个转导细胞/孔)中与等量的表达或不表达bcma蛋白的细胞一起孵育。共培养物保持在最终体积100μl的x-vivotm-15培养基(lonza)中，在37℃和5％ co2条件下培养6小时。在细胞刺激期间，通过在共培养开始时添加荧光抗cd107a抗体(apc偶联的，来自miltenyi biotec)以及1μg/ml抗cd49d(bd pharmingen)、1μg/ml抗cd28(miltenyi biotec)和1x monensin溶液(ebioscience)进行cd107a染色。6小时孵育期后，用可固定的活性染料(efluor 780，来自ebioscience)和荧光染料偶联的抗cd8(pe偶联的，miltenyi biotec)对细胞进行染色，通过流式细胞术进行分析。通过确定cd8+细胞中cd107a染色的平均荧光强度信号(mfi)，脱粒活性被确定为cd8+/cd107a+细胞的百分比。在pbmc/t细胞转导至少24小时后进行脱粒测定。[0253]抗bcma car t细胞对表达bcma的bcma表达癌细胞(rpmi8226和nci-h929)具有活性，而在其中所述car针对不相关靶标(例如小鼠cd19)的car t细胞或用gfp转导的t细胞中未检测到活性。当靶标为bcma阴性(k562细胞)时，任何一种类型的转导t细胞均为无活性/背景活性。实施例21[0254]bcma car的体内测试[0255]雌性nod-cg-prkdcscid il2rgtm1wjl/szj(nsg；jackson laboratories)小鼠接受皮下(s.c.)注射0.2ml含有5e7细胞/ml的e7 bcma+rpmi-8226mm肿瘤细胞的悬浮液以建立s.c.异种移植物。在肿瘤植入后约10-15天，带有异种移植物的小鼠接受单次静脉内(i.v.)注射0.2ml含有e5至e8人t细胞的细胞悬液。在约第18天，当平均肿瘤体积为96+/-16mm3并确认人t细胞的植入后，将小鼠随机分组，每组10只小鼠。各组接受iv施用car编码载体或对照载体，载体的剂量为e3、e4、e5、e6、e7、e8或e9 tu。可选的附加阳性对照组每周两次i.v.接受1mg/kg硼替佐米(velcade)，持续4周。监测小鼠的肿瘤生长直到约100天。与对照组相比，在某些小鼠组中观察到肿瘤生长抑制，而在其他小鼠组中没有观察到肿瘤生长抑制，这取决于所使用的剂量和载体制剂，确定了最有效的剂量和载体。实施例22[0256]含有非复制型逆转录病毒载体(表达靶向bcma的嵌合抗原受体并表达il-12p70)的cd8靶向/假型化颗粒的体内测试[0257]通过将抗cd8a scfv加入麻疹包膜蛋白(构建体52；seq id no：20)和截短的麻疹f蛋白，编码abcma-car和单链il12p70的非复制型逆转录病毒颗粒被假型化用于cd8+t细胞的体内转导，一旦病毒通过“h”蛋白杂交“对接”就会引起融合。这允许主要为cd8+t细胞的精细转导。这避免了其他增殖细胞类型的潜在转导，包括肿瘤细胞、非cd8+免疫细胞以及增殖肝细胞和内皮细胞。cd8+细胞的有效靶向也增加了转导的cd8+细胞的相对数量，因为未靶向的细胞不再充当载体沉积的场所。[0258]通过在8周龄的nsg小鼠(皮下植入了bcma阳性肿瘤细胞系且静脉注射了人pbmc)中静脉注射重组逆转录病毒载体bcma-car-il-12p70(由兼嗜性生产线和具有杂合包膜的生产线制备)，体内测试cd8靶向/假型化颗粒(含有表达靶向bcma的嵌合抗原受体且表达il-12p70的非复制型逆转录病毒载体)的功能效应。通过静脉注射向由10只动物/组构成的每个处理组施用剂量为1e6至5e8 tu的每种载体储备物或载体对照，用于效力评估(肿瘤体积)。在研究期间测量肿瘤体积。结果显示与对照处理的动物相比，用表达bcma-car-il-12p70的病毒载体进行处理减小了肿瘤体积。与对照和非靶向psma-car-il-12p70处理的动物相比，cd8-psma-car-il-12p70减小了肿瘤体积，并导致在某些情况下完全没有可测量的肿瘤。静脉注射重组逆转录病毒载体2天后外周血的流式细胞术分析证实，-car-il-12p70转导仅限于cd8+细胞，而非靶向的bcma-car-il-12p70转导可在广泛的免疫细胞群体范围内检测到，包括cd8+、cd4+、b细胞和单核细胞。此外，与非靶向载体相比，靶向载体转导的cd8+细胞百分比更高。实施例23[0259]除了来自健康供体的cd4+和cd8+外周血单核细胞外，还定量了来自非霍奇金淋巴瘤(以dlbcl为代表)和多发性骨髓瘤患者的原发性活组织检查的mirna的表达水平。提取样品以获得总rna，然后使用illumina small rna-seq文库构建处理以分离mirna。通过illumina nextseq测序对文库进行测序，每个样本约10,000,000个读长，使用单一末端读长，最小读长长度为1x75 bp。测序结果在r中进行处理和分析，以确定样本中的mirna表达。通过两种方法对测序得到的mirna表达谱进行差异和排序分析来识别靶标mirna及其相应的靶序列。[0260]非霍奇金淋巴瘤(nhl)候选mirna分析[0261]表2和表3显示了两种不同方法(差异或排序)的结果，用于计算和鉴定在dlbcl中表达但在t细胞中表达不佳的mirna。两个表中都突出显示了最靠前的候选者。表5显示了两种方法确定的共同靶标。[0262]表3：差异表达法(使用r isomirs包对计数数据进行差异表达分析)[0263]表4：排序百分位比较法(基于rpkm矩阵表，所有按细胞类型分组的mirna表达均按等级排序)；每个mirna的中位数rpkm表达值与这些值的log2fc一起显示在下表中。[0264]表5：来自差异表达法和排序比较法的共同靶标mirna[0265]多发性骨髓瘤(mm)候选mirna分析[0266]表6和表7显示了两种不同方法(差异或排序)的结果，用于计算和鉴定在mm中表达但在t细胞中表达不佳的最靠前的mirna。两个表格中都突出显示了最靠前的候选者。表6显示了两种方法确定的共同靶标。[0267]表6：差异表达法(使用r isomirs包对计数数据进行差异表达分析)[0268]表7：排序百分位比较法(基于rpkm矩阵表，所有按细胞类型分组的mirna表达均按等级排序)；每个mirna的中位数rpkm表达值与这些值的log2fc一起显示在下表中。[0269]表8：来自差异表达法和排序比较法的共同靶标mirna[0270]图12显示了理想mirna特征的示例箱形图，其相应的靶序列可用于基因治疗构建体以减少转基因的脱靶表达。nhl和mm中的强mirna候选者之间存在重叠，其中mirna hsa-mir-223-3p和hsa-mir-143-3p被鉴定为能减少这些癌症中的脱靶表达。候选mirna和rnv中编码的mirna靶序列被证实具有体外生物活性。例如，图13显示了在rnv载体中包含mirna靶序列的效果。将mir223-3p的靶序列插入gfp载体，得到序列pba-9b-gfpmir223-3pb-4tx(构建体7；seq id no：2)并用于制备感染性载体。mir223-3p是一种microrna，仅在单核细胞或骨髓细胞中以显著浓度产生。图13显示在u937单核细胞系中，与其他两种载体相比，gfpmir223感染的细胞系中的gfp表达降低了100倍。所有三种载体在ht1080纤维肉瘤细胞或其他非单核细胞中产生等量的gfp。实施例24[0271]创建兼嗜性包装和生产细胞系，用于编码人腺苷脱氨酶(ada)的逆转录病毒载体的大规模载体生产，或同时考虑提高安全性和高滴度的载体和临床应用[0272]质粒构建[0273]逆转录病毒载体构建体。图4a-c中概述了原始的n2衍生的逆转录病毒载体pkt-1(专利申请wo91/06852和wo92/05266)和它的所有安全性修饰。逆转录病毒载体pcbβ-gal衍生自pkt-1，编码β半乳糖苷酶和neor基因。同源性降低的载体pba-5b是向pkt-1中加入几个安全性修饰的结果。已包含att代替gag的正常atg起始位点的修饰的载体pkt-1，被修饰为在扩展包装信号(ψ+)中包含两个终止密码子；将att修饰的起始位点更改为终止密码子taa，在下游21nt处插入一个额外的tga终止密码子。5'ltr上游、3'ltr下游以及多聚嘌呤区和env终止密码子之间的所有无关的mlv衍生的逆转录病毒序列均被消除，产生载体pba-9b。[0274]momlv衍生的gag/pol构建体。对原始的momlv衍生的gag/pol质粒pscv10(专利申请wo91/06852、wo92/05266)进行安全修饰，以降低与逆转录病毒载体和env表达构建体的序列同源性(图4b)。表达盒pci-wgpm在gag编码区的约前400nt中包含简并密码，并且缺失所有的5'和3'的非翻译序列。此外，pol基因编码最后28个氨基酸的序列缺失，产生截短的整合酶基因。质粒pci-gpm和pscv10/5',3'截短型包含与pci-wgpm相同的gag/pol cdna，除了gag的5'区域包含天然序列。[0275]包膜构建体。为了减少gag/pol和逆转录病毒载体质粒中的序列重叠，原始的4070a衍生的兼嗜性表达质粒pcmvenvamdra(专利申请wo91/06852)被用于产生两个质粒(图4c)：在env终止密码子后的所有3'非翻译序列均缺失(pcmvenvamdralbgh)，或所有3'和5'非翻译序列均缺失(pcmv-β/envam)。异嗜性逆转录病毒包膜表达盒pcmvxeno衍生自nzb9-1，兼嗜性包膜表达盒pmlpenvam衍生自4070a。[0276]亲代细胞。人肾293细胞(atcc crl 1573)、人纤维肉瘤ht-1080细胞(atcc ccl 121)、犬肉瘤d-17细胞(atcc crl 8468)以及衍生自这些亲本细胞的逆转录病毒包装和生产细胞系都保持在dmem(irvine scientific，加利福尼亚州)中，dmem中添加了10％的γ辐照的成分确定的胎牛血清(fbs,hyclone laboratories inc.，犹他州)、20mm hepes(irvine scientific，加利福尼亚州)、1x非必需氨基酸和1mm丙酮酸钠。根据fda的指南，对用于产生临床载体生产细胞系的亲代细胞系进行储存和以下测试：来源(即同工酶分析和核型分析)、不存在表达的逆转录病毒序列和包括支原体、细菌、真菌和病毒在内的外来剂。[0277]假型vsv-g上清液的生产。按照yee等所概述且进行一些小的修改，进行浓缩vsv-g(水泡性口炎病毒糖蛋白)假型载体上清液(g-上清液)的大规模生产。简而言之，将ha-lb包装细胞(表9)以1×107个细胞/瓶接种到t225瓶中。12至20小时后，使用profection试剂盒(promega corp.，wi)，用vsv-g编码质粒pmlp-g和相应的逆转录病毒载体对细胞进行capo4转染。与dna沉淀孵育6-8小时后，移除dna悬浮液并添加新鲜培养基。12至20小时后，收集上清液并应用新鲜培养基。进行四到五次重复收集，汇集g上清液，过滤(0.45μm)，通过在9000g和8℃下离心8-18小时进行浓缩。将沉淀重新悬浮在少量新鲜培养基中，分装，在液氮中冷冻，并储存在-70℃。然后在进行生产汇集物和克隆的高m.o.t.生成之前，通过表达转移(toe，见下文)和pcr滴度分析评估这种浓缩的病毒上清液的滴度。实施例25[0278]基于mlv的包装和生产细胞系的产生和分析[0279]包装细胞系。详细描述了pcl da、2a、hx和2x的生成(专利号wo 91/06852和wo92/05266)，并进一步改进了程序用于产生pcl 2a-lb、ha-lb、haii，daii和dawob。通常，通过capo4介导的与腐草霉素或甲氨蝶呤标志物质粒的共转染，按顺序将逆转录病毒gag/pol和env表达质粒引入细胞中，然后进行2周的适当选择。分析选定的gag/pol中间体汇集物的p30表达，然后按照标准方案稀释克隆到96孔板中。对gag/pol中间体克隆进行如下分析：蛋白质印迹(多克隆山羊抗p30抗体，由j.elder友情提供)中的p30表达，以及通过用编码兼嗜性env和选择标记的逆转录病毒载体转导并滴定产生的载体所得的滴度潜力。将具有最高滴度潜力的克隆与逆转录病毒env表达质粒和标记物共转染，选择转染的细胞，稀释克隆，对pcl克隆进行如下分析：蛋白质印迹(多克隆山羊抗gp70抗体；quality biotech，马里兰州)中的gp70表达，以及滴度潜力。通过以高比率的载体/pcl，使用几种逆转录病毒载体构建体进入pcl的几轮转导来测试滴度潜力，以测试包装能力的限制。表9：基于mlv的包装细胞系的典型特征的概述注：n.d.未测定a滴度值表示vpcl汇集物和克隆的滴度，描述于本公开中或来自未显示的数据；b pcl先前描述于参考文献26、28和36中；c总共5种不同的基于da的逆转录病毒载体产物被用于临床试验(56)；d基于haii的人因子viii vpcl被用于血友病a试验(chiron公司赞助)。实施例26[0280]用于细胞特异性靶向的工程化改造的兼嗜性env[0281]可以通过修饰4070a env序列中富含脯氨酸的区域来工程化改造兼嗜性env。在图14中，显示了将gfp(作为追踪env表达的报告标记)或用于优先将病毒转导靶向cd8+细胞的抗cd8 scfv序列(以两个方向呈现)克隆到4070a包膜序列的富含脯氨酸区域的l(亮氨酸)密码子序列中。实施例27[0282]cd34靶向[0283]a.为了实现对cd34+细胞的靶向，麻疹h蛋白可以与各种靶向蛋白支架部分结合使用，以实现使用单链可变片段(scfv)单克隆抗体、设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)和识别2个不同受体表位的双特异性抗体的靶向。为了最大限度地减少个体针对麻疹病毒的预存在的免疫力，用于设计靶向部分的h蛋白的典型位置是edmonston麻疹毒株的h-noose-表位。为了使h蛋白不识别其天然受体，设计了点突变来破坏识别序列。对于靶向cd34+造血干细胞(hsc)，由于用抗hpca-1抗体刺激后在cd34+造血细胞上触发受体介导的内吞作用，cd34靶向的抗hpca-1单克隆抗体为优选使用的scfv部分并工程化改造至麻疹h蛋白序列中。具有抗hpca-1scfv的嵌合麻疹h蛋白的使用以及麻疹融合(f)蛋白的使用，将允许将mulv假型病毒载体靶向并融合到cd34+细胞。[0284]b.通过赋予在细胞进入水平的cd34+特异性，也可以使用sindbis病毒包膜蛋白将慢病毒和mulv载体假型化并靶向到cd34+细胞。已将蛋白a的zz结构域加入sindbis包膜中，通过抗体与靶细胞表面的特定抗原结合来实现载体转导。已在sindbis包膜糖蛋白中产生一些突变(包括e3蛋白中氨基酸61-64的缺失和e2蛋白中k159a、e160a和slkq68-71aaaa氨基酸的突变)，以降低sindbi的自然趋向性从而降低它的背景感染性，同时保持高载体滴度。e1蛋白中氨基酸226和227突变为s和g允许e1在不存在胆固醇的情况下在靶膜中介导融合，从而增加指定为包膜2.2的sindbis假型载体的趋向性和感染性。2.2载体已成功靶向ⅰ类人白细胞抗原(hla)、cd4、cd19、cd20、cd45、cd146、黑色素瘤细胞p-糖蛋白和前列腺干细胞抗原，以及用于靶向人造血祖细胞的cd34、cd133和c-kit。同样，靶向cd34+细胞的优选抗体为抗hpca1，克隆my10。然而，为了增加靶向性，允许同时使用抗hpca1和抗c-kit+部分的双特异性抗体的使用将增加靶向性。[0285]c.已将nipah嵌合包膜膜结合g蛋白和f蛋白变体用于细胞特异性靶向，这具有多种优势，例如：(1)显示在人群中不具有预先存在的免疫力，(2)具有更高的假型病毒滴度，以及(3)具有更高的表面密度。实施例28[0286]编码小鼠或人cd19 car逆转录病毒载体的生产细胞系[0287]对安全修饰的pba-9b逆转录病毒载体也进行类似的工程化改造，以其基本构建体形式编码小鼠或人抗cd19car载体构建体，该基本构建体由连接到4-1bb共刺激信号结构域和抗cd3z嵌合抗原受体(car)基因序列的scfv mab-hinge-tm结构域区域组成(图15a-b)。[0288]使用高多重性转导“高m.o.t.”方法(m.o.t.》20)使用单轮或多轮背对背转导，从克隆pcl建立逆转录病毒非克隆生产汇集物以及克隆(参见图6)。多重性转导被定义为用于产生vpcl非克隆汇集物的每个pcl细胞使用的感染性病毒颗粒的数量。通常，pcl培养物在转导前一天以1×105个细胞/孔接种在6孔板中。然后将适当体积的载体上清液添加到pcl中(在8μg/ml聚凝胺的存在下)，对应于0.1、0.5、5、25和125的m.o.t.。在20-24小时后，用2ml新鲜培养基替换载体上清液。为了增加m.o.t.，可以第二天使用相同体积的载体上清液重复转导过程。生产细胞汇集物生长至汇合，在汇合后24、48和72小时每天收集上清液以确定pcr滴度并赋予表达的转移。通过有限稀释接种到96孔板中来克隆选择的非克隆汇集物，实现每孔单个细胞，随着单个克隆组的扩增，通过几轮滴度测定和表达转移测定对其进行分析。实施例29[0289]用于细胞特异性去靶向的pba-9b-cd19car序列的修饰[0290]pba-9b-cd19 car基础序列可以被可以修饰为也编码microrna(mir)靶序列，作为以细胞类型特异性方式下调载体表达的有效方法，从而增加载体的安全性并防止在非预期的细胞类型中表达。图16显示了用于阻止骨髓、b细胞和nk细胞类型中的表达的示例性mir靶序列。实施例30[0291]修饰pba-9b以创建自灭活(sin)载体psin-ba9b[0292]为了提高逆转录病毒载体的安全性，可以工程化改造sin版本的pba-9b以消除由ltr插入诱变引起的致癌基因的激活。图17显示了具有克隆到多克隆位点的hcd19car基因的psin-ba-9b的示例性设计。实施例31[0293]逆转录病毒载体制剂的关键特性的确定[0294]a.通过pcr拷贝数定量来确定滴度。对载体样品进行pcr滴度分析。mlv特异性引物(5'-gcg-cct-gcg-tcggta-cta-g-3'，seq id no：26)、5'-gac-tca-ggt-cgg-gcc-aca-a-3'，seq id no：27)和探针(5'-agt-tcg-gaa-cac-ccg-gcc-gc-3'，seq id no：28)用于扩增80bp产物。扩增反应在50μl中进行，其具有200-400μm dntp、900nm引物和100nm探针寡核苷酸。检测产生的荧光，将基于原载体(provector)拷贝数的滴度表示为转导单位/ml(tu/ml)。转导单位被定义为相对于已知拷贝数标准的原载体拷贝数/基因组当量，并代表载体整合单位的真实反映。[0295]b.表达转移的测定和滴度确定。这种通用滴定测定采用ht-1080靶细胞，该细胞在转导前一天以3×105个细胞接种在六孔板(corning costar，纽约州)中。在转导前2小时加入聚凝胺(8μg/ml)，连续稀释载体上清液。在20-24小时后，用1-2ml新鲜培养基替换上清液。在测定上清液或基因组dna的基因产物表达转移(toe滴度)或存在的原载体拷贝数(pcr滴度)之前，允许细胞另外生长24-48小时。[0296]c.β-半乳糖苷酶表达转移滴度测定。通过两种独立的方法确定β-gal toe滴度。第一种方法是按照标准方案使用x-gal染色的生化染色程序。第二种方法是使用galacto-light plus试剂盒(tropix inc.，马塞诸塞州)的化学发光检测方法。[0297]d.具有复制能力的逆转录病毒(rcr)的检测。两个程序分别用于确定vpcl或载体产物中是否存在rcr。i)第一个程序测试了生产后的vpcl。将这些细胞接种到具有相同数量的可复制细胞系m.dunni的培养物中。vpcl以小规模(1×107个细胞)接种到培养瓶中或以大规模(1×108个细胞)接种到转瓶中。共同培养细胞几代，最后收获。使用标记补救或pg4s+l-测定法测试无细胞培养物上清液。用杂合鼠白血病病毒感染m.dunni细胞生成rcr产生细胞系，将其作为共培养过程的阳性对照。幼稚m.dunni细胞作为阴性对照。ii)第二个程序直接测试载体制剂。使用100ml接种体积/转瓶将未处理的收获产物或纯化的批量产物施加于m.dunni细胞。在短暂的接种期后，将150ml额外培养基添加到培养物中，细胞传代4到5次，然后收获培养物上清液的一部分，过滤，通过标记补救或pg4s+l-测试来测定rcr。根据最近的fda指导文件([www.]fda.gov)，对来自临床生产批次的300ml粗制载体进行rcr分析。用于产品放行的m.dunni扩增(大规模)和pg4s+l-检测方法已被验证用于单个单元rcr检测。实施例32[0298]使用多细胞工厂进行病毒生产[0299]以下实施例回顾了产生鼠白血病病毒(mulv)的生长贴壁vpcl细胞所需的细胞培养方法，用于进行病毒生产。尽管使用了mulv病毒的生产作为示例，但该过程也可用于本公开中描述的所有病毒。[0300]在本实施例中，描述了由亲代ht1080细胞(atcc ccl-121)产生vpcl，但该方法也可用于在37℃和5％ co2条件的优选条件下，由hek 293t细胞(crl-1573)、d-17(atcc ccl-183)和cf2th(atcc crl-1430)产生vpcl。对于长期储存，vpcl在液氮条件下冷冻保存，储存于冷冻保护剂塑料瓶中，装有冷冻在冷冻保护剂细胞培养基溶液中的1×107个细胞，该培养基溶液含有10％ dmso、在细胞培养生长培养基溶液中的50-90％胎牛血清。解冻后，通过以下方式扩增细胞：先接种到t-75培养瓶中，随后扩增到两个t-175中，随后在具有以下生长培养基的10个t-175培养瓶中培养：完全dmem培养基组分：比例1.dmem高葡萄糖,w/o酚红;w/o谷氨酰胺500ml2.γ射线辐照的fbs25ml3.glutamax(gibco)5ml4.非必需氨基酸(100x neaa储备物)5ml[0301]达到汇合后，用(sigma)收获细胞并使用标准细胞培养方法用相同的生长培养基进行中和。将细胞以3.1×10^4活细胞/cm2的优选接种密度在上述相同培养基中接种到三个10层cellstack(康宁)中，以产生病毒。每个cellstack含有1.1l生长培养基。cellstack在37℃和5％ co2下孵育。[0302]接种后两天，cellstack培养物将接近或达到汇合。用新鲜培养基更换每个培养物中的培养基。两天后，收获含有产生的病毒的培养基(收获#1)，用相同体积(1.1l)的新鲜培养基对培养物进行再进料。10小时后，进行第二次收获(收获#2)，用相同体积(1.1l)的新鲜生长培养基对细胞培养物进行再进料。在第2次收获后16小时，进行第3次收获(收获#3)。然后汇集3个收获以进行纯化。下表列出了3次收获和汇集物的病毒滴度。后汇集3个收获以进行纯化。下表列出了3次收获和汇集物的病毒滴度。实施例33[0303]使用相同技术通过另一个细胞系生产病毒。可使用实施例32中描述的相同培养技术在人细胞系hek293细胞(attc#crl-1573)和犬细胞系cf2th(atcc#crl-1430)或d-17(atcc#ccl-183)中生产任何本公开的病毒。如实施例32中所述，可以收集和汇集三个收获。使用cf2th细胞的收获汇集物的病毒滴度可以是4.9×106tu/ml。实施例34[0304]导致动员的hspc-壁龛相互作用的药理学抑制[0305]穿过骨髓内皮的迁移(即跨内皮迁移)是调节祖细胞动员的关键步骤。调节hspc从血液到骨髓的定向迁移和在骨髓壁龛中滞留的中心机制涉及通过趋化因子cxcl12(也称为基质细胞衍生因子1(sdf-1)(nagasawa等，1996；oberlin等，1996))激活hspc上的cxcr4受体，cxcl12在不同基质细胞亚群上表达，包括网状nestin+间充质干细胞和祖细胞(mspc)(mendez-ferrer等，2010)、人网状cd146+mspc(sacchetti等，2007)和瘦素受体+血管周围网状细胞(ding等，2012)。[0306]cxcl12由这些细胞分泌并被吸附到细胞外基质，诱导cxcl12梯度和诱导hspc粘附到骨髓壁龛(sugiyama等，2006)。干扰cxcl12/cxcr4的相互作用，例如通过小鼠中cxcr4或cxcl12的条件性缺失，导致hspc在骨髓中的滞留减少，并显著增加迁移到外周血和脾脏中的hspc数量(tzeng等，2011)。cxcl12(sdf-1)本身激活细胞表面整合素vla-4、vla-5和lfa-1(peled等，2000)。用cxcl12(sdf-1)激活cd34(+)细胞导致牢固的粘附和跨内皮迁移，这取决于lfa-1/icam-1和vla-4/vcam-1的相互作用；此外，cxcl12(sdf-1)诱导的cd34(+)/cxcr4(+)hspc的极化和通过位于内皮下的细胞外基质的外渗依赖于vla-4和vla-5(peled等，2000)。根据进一步的报道，cxcl12(sdf-1)还激活粘附分子cd44，从而快速有效地刺激hspc粘附到固定化透明质酸以及hspc向骨髓归巢，这可以被抗cd44单克隆抗体或可溶性透明质酸阻断，并且在静脉注射透明质酸酶后显著受损(avigdor等，2004)。因此，抑制cxcl12(sdf-1)/cxcr4的相互作用具有对多种hspc-基质粘附相互作用的下游影响。[0307]amd3100(普乐沙福)是双环酰胺类的合成有机分子，最初作为抗hiv药物被开发(de clercq 2019)。通过拮抗cxcr4受体，从而干扰将干细胞束缚在骨髓基质上的cxcr4/cxcl12(sdf-1)相互作用，amd3100被发现在各种动物模型中可快速动员hspc(broxmeyer等，2005)。在2008年，amd3100/普乐沙福(商品名mozobil)在美国获批与g-csf组合用于在非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤患者中动员hspc至外周血以进行采集和后续的自体移植，在g-csf介导的hspc动员未能诱导足够数量的hspc的情况下用作支持措施(de clercq 2019)。amd3100的快速动员不仅调节cxcl12的水平，还诱导基质金属蛋白酶9(mmp-9)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(upa)等蛋白酶的激活(dar等，2011)。经amd3100刺激后，活化的骨髓基质细胞和内皮细胞也在将cxcl12(sdf-1)分泌到循环中发挥作用(dar等，2011)。[0308]此外，amd3100已作为研究其他药物化合物的模型，该药物化合物类似地靶向cxcr4受体并可能用作干细胞动员剂，例如krh-1636和cx0714(de clercq 2019)。t-140(4f-苯甲酰基-tn14003)是另一种cxcr4抑制剂，可在小鼠模型中动员hspc和成红细胞，并显示出与g-csf的协同作用(abraham等，2007)。[0309]非拉司特是一种α4β1和α4β7整合素抑制剂，已被证明可破坏hspc在出生后造血壁龛中的滞留，并与cxcr4抑制剂amd3100协同相互作用(kim等，2016)。[0310]维得利珠单抗是一种针对α4β7整合素的人源化单克隆抗体，已上市，并已在克罗恩病和溃疡性结肠炎的临床试验中进行了测试，最近还用于预防同种异体hspc移植后的移植物抗宿主病(chen等，2019)。在用维得利珠单抗处理的小鼠中观察到血浆cxcl12水平降低，同时hspc排出减少。[0311]bop(n-(苯磺酰基)-l-脯氨酰基-l-o-(1-吡咯烷基羰基)酪氨酸)是一种也会对整合素α9β1/α4β1造成靶向干扰的化合物。据报道，单剂量的这种小分子拮抗剂可快速动员长期多谱系重组hspc，还可增强amd3100诱导的hspc动员(cao等，2016)。[0312]rac抑制剂：已发现造血祖细胞和hspc中表达的rac小gtp酶与hspc动员密切相关，rac活性(但不是cdc42或rhoa活性)的特异性抑制剂的应用可用于快速hspc动员(cancelas等，2005)。最近表明rac1激活导致人cxcr4的可逆构象变化，从而增强cxcl12/cxcr4信号，暗示了这些信号通路之间的相互串扰(zoughlami等，2012)。[0313]通过造血生长因子进行动员[0314]造血生长因子，尤其是粒细胞集落刺激因子(g-csf、非格司亭(filgrastim)、来格司亭(lenograstim))和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、莫拉司丁(molgramostim)、沙格司亭(sargramostim))，已被证明可有效地将hspc调动到外周血中，在单独使用造血生长因子动员的情况下比基线高出60倍(peters等，1993；gazitt，2002)。[0315]这种方法在可以前瞻性地计划时是有利的，并可以在没有相关化疗发病率的情况下进行动员。此外，患者可以在家中接受造血生长因子的施用以进行动员，然后作为门诊患者进行进一步的基因转移程序。[0316]g-csf：已证明内皮细胞是骨髓中感染诱导的g-csf表达的主要组成型来源(boettcher等，2014)。因此，这些信号很可能与hspc的动员有关或者是hspc动员的部分。值得注意的是，如通过透射电子显微镜研究所显示的，中性粒细胞可透化骨髓中的血窦内皮屏障(lee等，2009)。然而，在重复g-csf刺激期间，骨髓内皮屏障的破坏是显著的，这表明内皮细胞在hspc动员期间确实作为g-csf的靶标发挥作用(szumilas等，2005)。[0317]在成骨细胞中，scf/c-kit配体、il-7和vcam-1以及骨桥蛋白(作为hspc维持的反调节剂)在g-csf处理的动员过程中或β3肾上腺素受体激活后均被选择性地下调(mendez-ferrer，battista和frenette，2010)。由于g-scf刺激β-肾上腺素交感神经活动，这为诱导hspc动员的信号链提供了证据。[0318]此外，显示g-csf处理可诱导骨髓内中性粒细胞的强烈扩增，中性粒细胞是施用g-csf后在动员期间从骨髓中出来的第一种细胞(day和link，2012)。如果中性粒细胞不存在g-csf受体，则所有三种经典类型的外部刺激(即g-csf、化疗和趋化因子)引起的hspc动员都会被破坏，但如果在造血正常的情况下hspc不存在g-csf受体则不会被破坏(liu、poursine-laurent和link，2000)。特别地，已证明g-csf受体为环磷酰胺或il-8诱导的(但不是flt3l诱导的)动员所需要(liu、poursine-laurent和link，2000)。已证明中性粒细胞释放的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶(包括中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶g和mmp-9)可从基质壁龛细胞或hspc上切割vcam-1、c-kit、scf和cxcl12(sdf-1)(levesque等，2002；heissig等，2002)。这些蛋白酶由中性粒细胞释放，作为g-csf后的动员过程期间以及在趋化因子或化疗动员期间的最后一步，导致hspc和祖细胞快速外出进入循环。据报道，粒细胞集落刺激因子受体(g-csfr)在单核细胞中发出信号，通过抑制成骨细胞的支持作用和破坏cxcl12/cxcr4轴以动员hspc进入血流(christopher等，2011)。[0319]应注意的是，经g-csf作用，糖尿病小鼠表现出hspc在骨髓中的滞留增加和hspc动员不良(ferraro等，2011)。在这些动物中不存在用g-scf下调cxcl12(sdf-1)。该缺陷可以通过amd-3100的应用来补救，表明hspc的动员可能受到造血系统以外疾病的影响。hspc中c-met信号的缺失导致hspc从骨髓出来到血液受到严重损害，其中cxcr4的阻断阻止g-csf诱导的c-met活化和hspc动员(tesio等，2011；petit等，2002)。表皮生长因子也被证明可以抑制g-csf诱导的hspc动员(ryan等，2010)。[0320]骨髓生成素：骨髓生成素(mpo)是白细胞介素3(il-3)和g-csf受体的多功能激动剂，据报道，相对于普通非人灵长类动物中的对照细胞因子，它是造血集落形成细胞(cfc)和cd34+hspc的有效动员剂(mac vittie等，1999)。[0321]vegf：生长因子刺激的祖细胞产生大量细胞因子(例如血管内皮生长因子，vegf)，可以作用于内皮细胞以改变它们的生长、运动性、渗透性和窗孔。在静脉注射施用rhvegf164或组胺后15分钟内，出现血管渗漏的增加以及血液中hsc数量增加2至3倍(smith-berdan等，2015)。鼠模型(在没有vegf或vegf受体的情况下造血不会发生)表明，vegf也可能特别地参与造血祖细胞的动员和归巢(shalab等，1995)。然而，值得注意的是，施用vegf后用amd3100处理小鼠导致内皮祖细胞和基质祖细胞的动员，但抑制了hspc的动员(pitchford等，2009)。[0322]scf：循环hspc上的细胞因子受体(例如c-kit，细胞因子kit-配体(干细胞因子，scf)的受体)也被下调。因为膜结合细胞因子(例如kit-配体(scf))在骨髓基质细胞和内皮细胞上表达，c-kit也可以作为粘附分子，在祖细胞动员和归巢中发挥作用。在施用scf和flt3-l后也观察到骨髓中cxcl12(sdf-1)的下调(christopher等，2009)。与外膜网状细胞一样，成骨细胞分泌β-ar激动剂以下调cxcl12、vcam-1和scf的表达(katayama等，2006；mendez-ferrer、battista和frenette，2010)。[0323]补体因子：单核细胞通过补体级联反应(由放疗和化疗激活)参与其中，从而释放出作为过敏毒素的补体因子c3(c3a、desargc3a)和c5(c5a和desargc5a)剪切片段(ratajczak等，2013)。在稳态条件下，补体因子3(c3)敲除的小鼠在血液学上正常，但表现出在辐照或移植野生型hspc后的造血恢复显著延迟；c3补体因子增强hspc对cxcr4/cxcl12轴的反应(ratajczak等，2013)，也表明经典补体激活途径参与hspc动员。此外，补体因子5(c5)缺陷小鼠表现出受损的hspc动员(ratajczak等，2013)。[0324]鞘脂和核苷酸：除了cxcl12(sdf-1)及其受体cxcr4之外，还已知许多其他可诱导hspc迁移的化学引诱剂。这些包括与g蛋白偶联的1-磷酸鞘氨醇受体1(s1p1)偶联的鞘脂类1-磷酸鞘氨醇(s1p)(golan等，2012；ratajczak等，2014)和1-磷酸神经酰胺(c1p)(ratajczak等，2014)。此外，胞外核苷酸(例如三磷酸腺苷(atp)或三磷酸尿苷(utp))(rossi等，2007)、二价阳离子ca2+及其受体(car)(adams等，2006)以及h+(krewson等，2020)调节hspc以及干细胞壁龛的某些细胞(如例内皮细胞)的表面上的粘附分子。尽管在许多情况下尚不清楚这些分子的细胞来源，但它们的作用包括介导植入(移植后)、粘附(稳态下)和动员(它们的诱导后)。[0325]s1p：s1p和受体s1p1被认为调节hspc的稳态外出和来自骨髓的动员。s1p由成熟的红细胞和活化的血小板产生，导致血液中微摩尔的s1p浓度，主要与白蛋白和高密度脂蛋白(hdl)结合(pappu等，2007；liu等，2011)。由于在实体组织中只能检测到低浓度的s1p，认为在骨髓和血液之间存在恒定的s1p浓度梯度对于hspc的恒定稳态释放很重要。这一观点得到了以下发现的支持：用特异性抑制剂fty720抑制s1p1受体会降低hspc进入血流的稳态动员(golan等，2012；liu等，2011)。与此一致，s1p1受体在hspc中的过表达增加了s1p介导的迁移，体外显著抑制cxcl12(sdf-1)的cxcr4表面表达的减少诱导了迁移并降低了hspc向骨髓归巢的潜力(ryser等，2008)。此外，可能由于激活补体级联和膜攻击复合物导致的溶血增加，在用g-csf或amd3100(golan等，2012)的动员期间观察到血浆中s1p浓度瞬时增加(ratajczak等，2013；ratajczak等，2014)，表明s1p在动员期间参与了hspc的释放(golan等，2012)。骨髓中增加的s1p浓度还诱导骨髓巢蛋白+msc分泌cxcl12(sdf-1)，并降低hspc向血液中的释放(golan等，2012)。[0326]认为在hspc上表达的第二种s1p受体(s1pr3)参与hspc在骨髓壁龛中的滞留。s1pr3的抑制或敲除导致hspc向血液循环中的动员，因此s1pr3的拮抗作用抑制了骨髓和血浆中的cxcl12(sdf-1)浓度(ogle等，2017)。另一方面，s1pr3的拮抗作用增加了amd3100诱导的动员，表明s1pr3和cxcr4通路之间存在协同作用。[0327]c1p：在致死性辐照后，观察到骨髓微环境中的s1p和c1p水平升高；此外，外周循环hspc暴露于循环中存在的相对高水平的s1p和c1p。这两种机制都可能使对这些生物活性脂质的可能归巢梯度的反应脱敏(ratajczak等，2014)。[0328]atp和utp：5-核苷酸三磷酸(特别是atp和utp)参与p2核苷酸受体介导的对造血细胞(包括hspc)的增殖、分化、细胞死亡和趋化性的调节(lemoli等，2004)。utp被认为是代表内源性的危险信号，它会由于组织损伤和细胞死亡而被迅速释放到细胞外环境中。utp和其他核苷酸诱导白细胞迁移到受损组织中，通过诱导细胞增殖来刺激组织恢复，并通过激活抗炎途径促进免疫反应的消退(di virgilio、boeynaems和robson，2009)。在体外utp与hspc的预孵育显著改善了cxcr4诱导的hspc迁移，而utp本身仅诱导hspc的微乎其微的趋化迁移(rossi等，2007)。此外，单独用utp或用utp与cxcl12/sdf-1的组合进行预处理显著增加了细胞对纤连蛋白的粘附，utp预处理改善了人hspc向骨髓的归巢(rossi等，2007)。utp信号在pbsc动员中的作用仍有待阐明。百日咳毒素对cxcl12依赖性和utp依赖性的趋化性的抑制表明，rho鸟苷5'-三磷酸酶(gtp酶)rac2和它的效应物rho gtp酶激活的激酶1和2(rock1/2)参与utp调节的/cxcl12依赖性的hspc迁移(rossi等，2007)。[0329]尿苷二磷酸-葡萄糖：在应激反应中，尿苷二磷酸-葡萄糖(udp-glc)被释放到细胞外液中。已表明udp-glc可以动员长期群体恢复的hspc；与单独施用g-csf相比，udp-glc和g-csf的共同施用导致更大的hspc动员(kook等，2013)。在竞争性群体恢复实验中，与单独用g-csf动员的hspc相比，用udp-glc和g-csf动员的hspc群体恢复地更好。与g-csf相比，udp-glc动员的hspc表现出更强的淋巴偏向的分化能力，表明udp-glc动员了功能上不同的hspc子集(kook等，2013)。相比之下，抑制实验表明，活性氧(ros)是udp-glc介导的hspc动员的媒介。ros抑制剂n-乙酰基-l-半胱氨酸(nac)的应用能够显著消除udp-glc诱导的hspc动员。kook等表明，ros诱导核因子κ-b配体(rankl)的受体激活剂的表达和rankl诱导的破骨细胞分化的增加，导致hspc动员(kook等，2013)。[0330]ca2+和car：hspc表达七次跨膜的car，它与hspc在干细胞壁龛中的滞留和从干细胞壁龛中的释放密切相关。car缺失的新生小鼠表现出骨髓中细胞的减少和原始hspc的缺乏，而在循环和脾脏中发现hspc数量的增加。car-/-小鼠的胚胎肝脏具有正常数量的hspc，这些hspc具有正常的增殖、分化和迁移能力。但是，这些hspc表现出对胶原蛋白i的粘附缺陷，导致在骨内壁龛的居留缺陷(adams等，2006)。另一方面，用car的正向变构调节剂西那卡塞对car进行药理学激活，导致hspc对胶原蛋白i和纤连蛋白的粘附增加，在体外向cxcl12(sdf-1)的迁移增加，在体内向骨内壁龛的归巢和在骨内壁龛居留的增加(lam、cunningham和adams，2011)。ca2+处理增加了骨髓细胞cxcr4的转录和表达以及sdf-1介导的cxcr4内化，同时ca2+流抑制剂或用抗体阻断car抑制了ca2+诱导的cxcr4表达，这表明ca2+诱导的hspc变化部分受到cxcr4表达增加的调节(wu等，2009)。[0331]促进cxcr4加入膜脂筏的分子：发现了阳离子抗菌肽(camp)、组织蛋白酶抑制素(cathelicidin)ll-37、β2-防御素和c3a显著提高hspc对皮摩尔水平的cxcl12(sdf-1)(1-2ng/ml)的反应性，这反映了组织中cxcl12(sdf-1)的生理浓度，支持了这类分子在hspc中的生物学意义(wu等，2012)。这些分子改善了cxcr4受体向膜脂筏的加入(ratajczak等，2013)。在膜脂筏内装配了几种细胞信号分子，例如小的鸟嘌呤核苷酸三磷酸酶(gtp酶)rac-1和rac-2，已知它们对于hspc到壁龛中的居留很重要，或在被阻断时对动员很重要(cancelas等，2005)。cxcr4和rac-1在脂筏中的共定位可以改善gtp的结合和rac-1的激活。[0332]组织蛋白酶抑制素ll-37是一种由骨髓基质细胞表达的抗菌肽，在骨髓被辐照后它的表达被上调。研究显示ll-37可增强hspc的趋化迁移和粘附性，在移植前hspc与ll-37的短时预孵育可加速小鼠的血小板和中性粒细胞计数的恢复(wu等，2012)。ll-37对动员的影响尚未确定。[0333]前列腺素e2：鼠和人hspc表达前列腺素e2(pge2)受体。在鼠移植实验中，体外短期暴露于pge2可增强hspc的归巢和增殖，并增加原始、长期群体恢复细胞的数量，这表明pge2支持hspc的自我更新(north等，2007；hoggatt等，2009)。相反，pge2抑制未成熟骨髓祖细胞的分化，其中未成熟骨髓祖细胞的分化导致粒细胞巨噬细胞集落形成单位(cfu-gm)和巨噬细胞集落形成单位(cfu-m)(pelus等，1979)，表明了pge2对造血功能的差异调节。通过非甾体类抗炎药(nsaid)(例如吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬和美洛昔康)阻断pge2产生，使g-csf诱导的hspc动员加倍。g-csf+nsaid动员的移植物的移植与移植后造血功能的更快再生有关(hoggatt等，2013)。peg2在骨髓壁龛中的重要性受到以下发现的支持：i)受辐照的骨髓基质细胞使pge2产生增加，以及ii)基质细胞中c1p和s1p诱导的环氧合酶2的表达增加，c1p和s1p由此从受到致命辐照的受损骨髓细胞中释放出来，这表明通过致命辐照对hspc移植进行调节会诱导骨髓中pge2的产生(ratajczak等，2014)。[0334]pge2处理增加了细胞cxcr4 mrna的浓度和cxcr4在hspc表面上的表达，导致体外向sdf-1/cxcl12的迁移和体内向骨髓的归巢增强。此外，由于生存素表达的增加和胞内活性caspase-3的减少，pge2提高了hspc的存活(hoggatt等，2009)。另一个对调节pge2介导的hspc滞留和hspc外流到血液重要的机制是调节骨桥蛋白的表达。研究表明，nsaid对pge2合成的阻断导致骨桥蛋白表达减少，这导致hspc在干细胞壁龛中滞留(hoggatt等，2013)。此外，骨桥蛋白是干细胞池大小的负调节因子，骨桥蛋白的下调或缺失与原始hspc数量的增加有关(stier等，2005)。因此，与单独用g-csf动员的移植物相比，由基质细胞表达的骨桥蛋白可能与g-csf和nsaid动员的干细胞移植物具有的更好的群体恢复能力和长期植入有关(hoggatt等，2013)。[0335]epi-x4是一种内源性人cxcr4拮抗剂：epi-x4是一种16个氨基酸的肽，它分离自人血滤出物和血浆，在酸性条件下通过天冬氨酸蛋白酶组织蛋白酶d和e由白蛋白产生，在炎症过程中由免疫细胞释放(zirafi等，2015)。研究显示中性粒细胞可以由白蛋白产生epi-x4(zirafi等，2015)。由于骨髓中的中性粒细胞在用g-csf动员hspc期间被强烈激活，其导致高度蛋白水解环境(levesque等，2002)，以及由于白蛋白遍布于骨髓的细胞外空间，因此在骨髓中通过epi-x4的产生调节cxcr4/cxcl12(sdf-1)轴是可能的，这与以下想法一致：将epi-x4单次腹膜内注射到小鼠中导致hspc的显著动员，该hspc植入受到致死辐照的宿主(zirafi等，2015)。[0336]cxcr2激动剂的截短形式，groβ：最近报道了一种快速干细胞动员方案，该方案利用人cxcr2趋化因子激动剂的n末端4-氨基酸截短形式groβ与cxcr4拮抗剂amd3100的组合(hoggatt等，2018)。将这两种药剂单次注射到小鼠体内导致干细胞动员在15分钟内达到峰值，这与标准的g-csf多日方案相当。这种快速动员由中性粒细胞上的协同信号引起，导致mmp-9释放增强，并且发现mmp-9中的遗传多态性可以改变该方案的活性(hoggatt等，2018)。之前在非人灵长类动物中单独使用或与g-csf组合使用n末端截短的groβ(各自命名为sb-251353(king等，2001)或sk;f 107647(king等，2000))报告了类似的结果(king等，2001)。[0337]西地那非：一种可能依赖于单核细胞并调节hspc动员的因子是一氧化氮。诱导型一氧化氮合酶(inos)-/-小鼠的动员研究表明，inos是造血细胞迁移的负调节剂，可防止hspc在动员过程中外流进入外周血(adamiak等，2017)。枸橼酸西地那非(伟哥)是5型磷酸二酯酶(pde5)的抑制剂，可阻断沿血管排列的平滑肌细胞中环gmp的降解，从而导致血管舒张。这种抑制是即时的，在口服药物后2小时达到峰值活性(andersson，2018)。最近的研究发现，单次剂量口服枸橼酸西地那非与单次注射cxcr4拮抗剂amd3100组合的2小时快速方案实现了hsc的有效动员，动员水平与g-csf(非格司亭/优保津(neupogen))的5天标准治疗方案相当(smith-berdan等，2019)。[0338]动员方案的选择影响hspc表型[0339]抗原表达分析表明，动员的和稳态的cd34+细胞之间存在表型差异，无论是否化疗，动员造血生长因子的选择都可能影响cd34+细胞的收获亚群。因此，动员方案的选择可能会影响来自动员的hspc的特定细胞系的造血重建。[0340]通过cd19的低表达和cd71的低表达确定，环磷酰胺动员的cd34+细胞几乎没有前b淋巴细胞，这表明缺乏活跃增殖以及不同患者之间亚群发生率的差异。[0341]相反地，化疗和g-csf的动员显示出在不同患者中cd33和cd71共表达的异质性，以及cd71高水平的表达。[0342]越来越多的证据表明，移植的原始cd34+cd33-细胞的数量而不是衍生自该细胞的异源cd34+细胞群可更准确地预测长期血小板的恢复。[0343]缺乏cd38抗原的表达(cd38–)是早期人祖细胞的一个特征，其可能受到所采用的动员方案的影响。与化疗加g-csf(97％表达cd38)、化疗加gm-csf(96.4％表达cd38)或单独高剂量化疗(99.1％表达cd38)动员的那些相比，g-csf动员的pbpc含有显著更高比例的原始祖细胞(仅88％的细胞表达)。[0344]类似地，已描述了可以预测长期培养起始细胞(ltcic)收获产量增加的特定动员方案。实施例35[0345]用于动员的化疗药物方案[0346]与稳态水平相比，在骨髓抑制化疗后的恢复期，循环hspc的数量可显著增加。[0347]例如，4g/m2单剂量的环磷酰胺可导致cfu-gm的数量增加多达25倍。[0348]类似地，4-7g/m2剂量的环磷酰胺后，cd34+细胞产量可以达到3.62×106个细胞/kg的数量级。[0349]高剂量的依托泊苷(2g/m2)也可作为一种安全有效的动员hspc的方法。[0350]高剂量环磷酰胺与依托泊苷(600mg/m2)的组合导致hspc的动员，其中cfu-gm和cd34+细胞含量优于单独的化疗剂所能达到的含量。[0351]在诱导化疗方案的第一个周期后，动员的集落形成细胞的数量似乎最高，在随后的每个周期后数量减少。[0352]然而，对这些动员细胞的分析显示，第四个化疗周期后cd34+细胞的比例高于第一个周期后cd34+细胞的比例。[0353]化疗诱导的动员可以避免有效抗癌治疗的施用的延迟，并允许除hspc动员之外的体内清除。实施例36[0354]用于动员的造血生长因子方案[0355]g-csf：单独使用g-csf可以有效地将hspc从骨髓动员到外周血中。[0356]非格司亭10μg/kg/天的剂量通常是足够的，但一些研究使用了16μg/kg/天。[0357]dürhsen等首先注意到g-csf增加循环祖细胞数量的能力；进一步研究表明，在患有各种恶性疾病的患者中，g-csf将祖细胞从骨髓动员到外周血中。[0358]sheridan等研究了在17名预后不良的非髓系恶性疾病患者中单独使用g-csf(12μg/kg/天，持续6天)动员pbpc，收获了33×104cfu-gm/kg的平均总量。类似地，g-csf(10μg/kg/天)在34名霍奇金病或nhl患者中充分动员了pbpc，允许收获中位数为32.6×104cfu-gm细胞/kg和2.8×106cd34+细胞/kg。de arriba等报道了10名乳腺癌患者在单独使用g-csf(0.84±0.1μg/kg/天)动员后，第一次和第二次白细胞去除术后的平均产量分别为0.77×106cd34+细胞/kg和1.42×106cd34+细胞/kg。[0359]g-csf剂量反应效应。动员剂量反应效应在健康成人和患者中很明显。g-csf剂量从5μg/kg/天增加到10μg/kg/天导致外周血的cd34+含量从基线的7倍增加到28倍。[0360]类似地，将g-csf的剂量从10μg/kg/天增加至24μg/kg/天显著提高了cd34+hspc产量(11.32×107/kg细胞vs 48.25×107/kg细胞)。[0361]动员的pbpc的特征也可能受施用的g-csf剂量大小的影响。当g-csf的剂量从100增加到200μg/m2时，可能会增加较不成熟的祖细胞(即，混合集落形成细胞、cd34+cd33-细胞和cd34+hla-dr-细胞)进入循环的动员。[0362]实践示例(g-csf)：根据目前对hspc动员的剂量推荐，非格司亭或来格司亭的从头动员施用剂量为10μg/kg/天，或与化疗组合使用时非格司亭或来格司亭的施用剂量为5g/kg/天(amgen；chugai pharma uk ltd/-poulenc rorer)，至少4天。病毒载体输注可在第5天开始并持续连续3天。[0363]gm-csf：gm-csf对动员hspc也是有效的，在癌症患者中通过连续静脉输注4-64μg/kg/天的剂量达到7天，导致外周血的hspc增加4至18倍。[0364]单独使用gm-csf可实现hspc的动员，但应注意，虽然已经证实使用gm-csf进行祖细胞动员的可行性，但没有证据表明其相对于单独使用g-csf动员具有优越性。[0365]在hohaus等的双盲研究中，26名复发性霍奇金病患者接受了化疗，在化疗后的第一天开始随机接受g-csf(5μg/kg/天，n＝12)或gm-csf(5μg/kg/天，n＝14)。未观察到cd34+细胞中位数产量的显著差异(g-csf和gm-csf分别为7.6×106 vs 5.6×106个cd34+细胞/kg)。[0366]villeval等对37名患者进行0.3-30μg/kg/天皮下输注或0.3-20μg/kg/天短时间静脉输注，结果发现治疗4-5天后血液gm-cfc水平显著升高，此外还有明显的剂量反应效应。[0367]由gm-csf动员的hspc群体的cfu-gm含量似乎是剂量响应的，其中250μg/m2剂量产生的产量优于125μg/m2。[0368]然而，应注意的是，虽然单独施用g-csf(5μg/kg/天)或gm-csf(5μg/kg/天)4天会导致cfu-gm的收获量超过基线的显著增加(分别为35.6和33.7倍)，但对已经接受7天gm-csf(5μg/kg/天)的患者再施用5天g-csf(5μg/kg/天))导致hspc超过基线增加80倍。[0369]然而，在健康受试者中，与单独用csf(10μg/kg/天)来动员相比，用g-csf(5μg/kg/天)和gm-csf(5μg/kg/天)的组合来动员没有导致收获产量的显著增加(平均数，分别为101×106cd34+细胞/kg vs 119×106cd34+细胞/kg)。实施例37[0370]化疗加造血生长因子的动员方案[0371]将造血生长因子引入基于化疗的动员方案的目的是提高hspc产量，同时支持早期抗癌治疗。与单独化疗相比，化疗后添加造血生长因子显著增加了动员的hspc数量。[0372]如前所述，动员方案中包含化疗可能对某些肿瘤治疗的迅速开始很重要。然而，当不需要这样时，应仔细考虑化疗的不良反应，仅使用造血生长因子的动员方案可能更合适。此外，与单独使用g-csf进行动员相比，重复化疗加g-csf可能会导致诱导更少的长期培养起始细胞(ltc-ic)。[0373]已经采用了多种组合方案，虽然没有关于最佳剂量或时间表的共识推荐，但通常使用的组合为4-7g/m2的环磷酰胺加5μg/kg/天的g-csf。[0374]临床方案[0375]g-csf加环磷酰胺：已显示g-csf与高剂量环磷酰胺(4-7g/m2)的组合可提高血液中cd34+hspc水平的产量。[0376]可以使用更高剂量的环磷酰胺提高hspc的产量。例如，多发性骨髓瘤患者可以使用大剂量环磷酰胺(7g/m2)加g-csf(300μg/天)进行动员，产生比用环磷酰胺(4g/m2)加g-csf获得的显著更高的》2.5×106cd34+细胞/kg的产量。[0377]g-csf加依托泊苷：已显示依托泊苷可以有效治疗nhl、霍奇金病以及在较小程度上治疗乳腺癌。将患有此类恶性肿瘤的患者纳入动员方案是合乎逻辑的，以便在动员阶段期间提供治疗。[0378]例如，患有乳腺癌、nhl或霍奇金病的患者以如下方式动员hspc：在依托泊苷输注完成后48小时，开始连续静脉输注24小时高剂量的依托泊苷(2g/m2)加g-csf(5μg/kg/天)。[0379]如通过以下证明的，动员方案是有效的：分别在霍奇金病、nhl和乳腺癌患者中进行动员，中位数产量为：24×106个cd34+细胞/kg(范围：9.5-27.7×106个/kg)、28.0×106个cd34+细胞/kg(范围：1.7-81.8×106个/kg)、22.7×106个cd34+细胞/kg(范围：2.7-79.3×106个/kg)，从白细胞计数恢复至1×109个/l的第一天开始测量(中位数为依托泊苷后10天，范围7-16天)。[0380]g-csf加环磷酰胺加依托泊苷：在患有乳腺癌、骨髓瘤和其他恶性肿瘤的患者中，也可以通过高剂量环磷酰胺(4g/m2)加依托泊苷(600mg/m2)(组合或不组合g-csf)实现hspc的动员。动员方案中包含g-csf导致比单独使用环磷酰胺和依托泊苷的动员的cd34+细胞的产量多出近5倍。[0381]g-csf加组合化疗：在乳腺癌患者中，第1天静脉内施用5-氟尿嘧啶(500mg/m2)、表柔比星(120mg/m2)和环磷酰胺(500mg/m2)的组合化疗，从第2天开始施用g-csf(10μg/kg/天)，导致中位数为17.7×106(范围：9.4-50.6×106)cd34+细胞/kg。[0382]类似地，在环磷酰胺加g-csf的组合方案中进一步添加其他化疗药物(包括但不限于例如紫杉醇)可以进一步改善动员。实施例38[0383]临床hiv预防[0384]此前，两名hiv阳性患者(被称为“柏林”和“伦敦”患者(r.k.gupta等，nature 2015))接受了来自ccr5δ32纯合供体的同种异体骨髓移植，表现出缓解和完全没有可检测的hsc移植后的病毒血症。因此，从hsc中敲除ccr2和/或ccr5是预防hiv感染或使已感染hiv的患者得到缓解的可行方法。非复制型逆转录病毒载体(pba-9b)被工程化改造为含有减少或敲除hsc的ccr5或ccr2基因表达的几种机制之一。在一个示例中，载体编码敲除ccr5的crispr/cas9和向导rna(图18a)。在另一个示例中，载体编码敲除ccr2的crispr/cas9和向导rna(图18b)。在其他示例中，载体编码敲除ccr5和ccr2的crispr/cas9和向导rna(图18c)。在进一步的示例中，载体编码单链抗体，包括骆驼科动物和鲨鱼抗体或其他蛋白结合分子，例如darpin、affimer、hikamer等(u.h.wiedle等，cancer genomics;proteomics 10:155-168,2013；k.skrlec等，trends in biotechnology,33:408-418,2015)，其在靶细胞内产生并阻断ccr5蛋白的活性。[0385]进一步的实施方式包括添加谱系特异性启动子，以便在期望的t细胞群中敲除ccr5和ccr2。在本示例中，crispr/cas9由cd3启动子驱动，使得crispr/cas9在t细胞谱系(来自载体转导后的hsc)中表达，随后hsc成熟(图18d)。可以用其他的t细胞启动子进行取代，包括cd4和cd8启动子。[0386]在进一步的实施方式中，载体编码单链抗体，包括骆驼科动物和鲨鱼抗体或其他蛋白结合分子，例如darpin、affimer、hikamer等(u.h.wiedle等，cancer genomics;proteomics 10:155-168,2013；k.skrlec等，trends in biotechnology,33:408-418,2015)，其在靶细胞内产生并阻断ccr5和/或ccr2蛋白的活性(图19a-d)。[0387]在又一个实施方式中，使用与crispr/cas9系统相同的构造，将crisp/cas9替换为敲低ccr5和/或ccr2表达的shrna或microrna或沉默rna(均被称为sirna)(图20a-d)。[0388]除了预防和引起hiv感染患者的缓解之外，图21中描述的载体还被用于治疗被诊断为患有多发性硬化症的患者。在此实施方式中，使用hsc谱系特异性的cd3启动子，使用crispr/cas9或sirna去除或减少t细胞中ccr5和ccr2的表达。此外，该载体包含细胞杀伤开关、胸苷激酶(tk)，它能够终止治疗或停止急性炎症发作，其中患者被给予tk前药，该tk前药被转化为杀死表达tk的细胞的有毒化学物质(图21)。人的示例：1.一名hiv病毒血症患者，该患者停用抗病毒药物(已知或可能抑制逆转录病毒载体)2-10天，然后施用剂量为e6、e7、e8、e9、e10、e11或e12的临床可接受(gmp)的逆转录病毒载体的制剂，该逆转录病毒载体含有敲除ccr5的crispr/cas9和向导rna的转基因。载体输注辅以适当的佐剂，将hsc从相对难以接近的骨髓动员到可接近的外周，如本文实施例中所述。植入后患者的t细胞随时间推移显示ccr5表达缺失，随后血液中阳性细胞中的hiv dna阳性t细胞水平降低，转导的无hiv的t细胞水平升高。在患者hsc中ccr5敲除的有效植入和随后的t细胞更新后，大多数的患者t细胞转化为ccr5阴性，在1-3个月内对hiv感染有抵抗力。随着时间的推移，艾滋病毒从患者体内清除，患者进入长期缓解期，对艾滋病毒产生长期抵抗力。2.一名处于疾病早期炎症阶段的多发性硬化症患者，该患者接受服用逆转录病毒载体的gmp制剂，该载体的滴度为pc3细胞上的e8 tu/ml以上，目的在于在载体转导后沉默hsc和后代t细胞中的ccr2/5。剂量参数与用适当的动员剂预处理的hiv患者所用的参数相同或相似。ccr2和ccr5的缺失可防止t细胞向ms相关的炎症迁移并防止组织受损。此外，在ms急性期给予ms患者更昔洛韦，导致标记的t细胞耗竭和患者的mri测量的病变减少。然后患者接受重复的载体/动员剂治疗以恢复hsc群。可被mri检测的病变的减少与患者t细胞中ccr2/5的丢失有关。3.一名小儿腺苷脱氨酶(ada)重度缺陷组合免疫缺陷(scid)患者，该患者服用逆转录病毒载体的gmp制剂，该载体的滴度为pc3细胞上的e8 tu/ml以上，使人ada在转导的细胞中表达。剂量为e6至e12的总tu，在此之前适当服用hsc动员剂。如“a.aiuti等，nejm 2009”所述，在将体外转导的自体干细胞常规移植到小儿ada scid患者体内后，恢复到正常或伪正常的免疫功能。实施例40[0389]使用普乐沙福在没有或有g-csf的情况下有效动员hsc的详细人体给药方案[0390]普乐沙福可用于特异性地动员cd34+hspc，可单独使用或作为g-csf的辅助剂使用。普乐沙福使用的剂量为第5天160μg/kg x 1，g-csf为第0、1、2、3和4天10μg/kg，或者如果单独使用普乐沙福，则为240μg/kg。对于传统基于g-csf的动员，单剂量为240μg/kg的普乐沙福(皮下注射)可以提供更快速、毒性可能更低且更简便的替代方案。然而，g-csf(每天皮下注射10μg/kg至多8天)与普乐沙福(从第4天晚上开始每天皮下注射持续至多4天，剂量(每日)为240μg/kg)的组合，已获得fda批准并推荐用于非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤患者的自体干细胞动员和移植。[0391]普乐沙福的常规剂量为240μg/kg，但该剂量可以安全地增加(在健康个体中)至480μg/kg。皮下注射240μg/kg的普乐沙福后，血液中的cd34+hspc计数在8-10小时内从1-2个细胞/μl升高至约25个细胞/μl的峰值，然后逐渐减少但到注射后24小时仍为约10个细胞/μl。如果皮下注射480μg/kg的普乐沙福，血液中的cd34+hspc计数在8-10小时内从1-2个细胞/μl升高至约30个细胞/μl的峰值，然后逐渐减少但到注射后24小时仍为约20个细胞/μl。实施例41[0392]使用西地那非(伟哥)和普乐沙福动员hsc的详细小鼠方案[0393]在单次皮下(sq)注射amd3100(2.5mg/kg)前1小时，通过经口服灌胃(og)(3mg/kg)向小鼠施用伟哥一次。对照小鼠接受5天的g-csf处理，每天施用一次(250mg/kg)。在施用amd3100后1小时或施用g-csf后24小时通过灌注收集血液，通过流式细胞术和致命辐照接受者的多向重建进行分析。[0394]五天的多剂量g-csf动员并不明显优于2小时的伟哥+amd3100的动员方案。更高剂量的伟哥(10和30mg/kg)也改善了amd3100介导的hsc动员，但并不比3mg/kg更有效。此外，与单独的amd3100相比，3天口服伟哥方案与单次amd3100注射的组合导致血流中的hsc明显更多。与对照小鼠相比，单独使用amd3100、amd3100+单剂量伟哥以及amd3100+3天的伟哥，hsc表型的数量分别增加了3倍、7.5倍和8.5倍。在快速2小时(2,500个hsc/小鼠)和3天(2,800个hsc/小鼠)的伟哥/amd3100组合中，血液中hsc的数量与连续4天注射g-csf后1天的数量(3,400个hsc/小鼠)相似。实施例42[0395]体内造血干细胞/祖细胞(hspc)的rnv转导[0396]小鼠hspc的特征为lin-、sca1+、kit1hi(lsk)。[0397]在体内用高滴度(》e8 tu/ml)纯化的编码gfp的rnv转导后，从外周血(pb)、脾脏(s)和骨髓(bm)中收获hspc，通过两种不同测定法来表征：集落形成；以及facs分析。[0398]动员方案被显示在目标动物(balb/c小鼠)中有效。使用balb/c小鼠动员hspc。如下使用环磷酰胺+gcsf+amd3100来动员第一组(第1组)：·环磷酰胺+g-csf+amd3100动员方案·第0天：环磷酰胺(cy)(ip)每20g小鼠4mg/100μl(200mg/kg/天)·第1天：g-csf(sc)每天每20g小鼠5μg/μl(250μg/kg/天)·第2天：g-csf(sc)每天每20g小鼠5μg/μl(250μg/kg/天)·第3天：g-csf(sc)每天每20g小鼠5μg/μl(250μg/kg/天)·第4天：在最后一剂g-csf后12-14小时内注射amd3100(sc)，每20g小鼠100μg/μl(5mg/kg)在施用amd3100后1小时，收获外周血(pb)、脾脏(s)和骨髓(bm)，通过facs分析pb、s和bm中存在的hspc(小鼠lin-、c-kit+、sca-1+)。[0399]第二组(第2组)未被动员。[0400]表10中概述了facs分析的结果。[0401]表10：外周血(pb)、脾脏(s)和骨髓(bm)中hspc(lin-、sca1+、kit1+)动员的facs分析结果的概述。单个数字代表来自单个小鼠的值。[0402]这些实验表明hspc被动员到了外周。[0403]体内造血干细胞/祖细胞(hspc)转导[0404]接下来，如上进行(a2实验)实验，但随后在体内进行2小时的逆转录病毒(rv)转导。使用了三组balb/c小鼠：第1组-动员，无rv(n＝3只小鼠，#1、2、3)；第2组-动员+rv(n＝6只小鼠，#4、5、6、7、8、9)；第3组-未动员，无rv(对照)(n＝1小鼠，#10)。[0405]在rv转导后2小时采集外周血(pb)、脾脏(s)和骨髓(bm)。将pb、s和bm细胞培养3天，通过facs分析gfp+hspc(lin-sca+kit+细胞)。通过将pb、s和bm细胞在甲基纤维素中培养5天以查看hspc集落是否为gfp+来进行gfp+hspc的多向重建。[0406]接下来，如上进行(a3实验)实验，但随后在体内进行2天的逆转录病毒(rv)转导。使用了三组balb/c小鼠：第1组-动员，无rv(n＝3只小鼠，#1、2、3)；第2组-动员+rv(n＝6只小鼠，#4、5、6、7、8、9)；第3组-未动员，无rv(对照)(n＝1小鼠，#10)。[0407]在rv转导后2天采集外周血(pb)、脾脏(s)和骨髓(bm)。将pb、s和bm细胞培养3天，通过facs分析gfp+hspc(lin-sca+kit+细胞)。通过将pb、s和bm细胞在甲基纤维素中培养10天以查看hspc集落是否为gfp+来进行gfp+hspc的多向重建。[0408]参见图23，脾脏中gfp+细胞的照片。表11显示了实验a2的结果。[0409]表11：用rnv-gfp对来自pb、s和bm的hspc进行动员和转导；低于0.1％的数字被计为零，因为这是facs机器的可靠检测的极限。[0410]表12：(实验a2)hpsc动员，随后体内进行2小时的rnv转导：外周血(pb)；cfu：集落形成单位，m：单核细胞/巨噬细胞，g：粒细胞，gm：粒细胞/巨噬细胞，gemm：粒细胞/红细胞/巨噬细胞/巨核细胞。1+2+3：来自动员但未转导的阴性对照的汇集的外周血，4到9：来自动员且rnv转导的小鼠个体的外周血，10：来自未动员且未转导的对照的外周血：[0411]表12显示了在methocult gfm3434(stem cell technologies)中，在12孔板中每孔培养4×104个外周血(pb)细胞5天后获得的gfp+造血干细胞/祖细胞(hspc)衍生集落的数量。[0412]表13：(实验a2)hpsc动员，随后体内进行2小时的rv转导：脾脏(s)；cfu：集落形成单位，m：单核细胞/巨噬细胞，g：粒细胞，gm：粒细胞/巨噬细胞，gemm：粒细胞/红细胞/巨噬细胞/巨核细胞。1+2+3：来自动员但未转导的阴性对照的汇集的脾细胞，4到9：来自动员且rnv转导的小鼠个体的脾细胞(注：由于技术困难，#7、#8没有形成集落)，10：来自未动员且未转导的对照的脾细胞：[0413]表13显示了在methocult gfm3434(stem cell technologies)中，在12孔板中每孔培养2×105个脾脏(s)细胞5天后获得的gfp+造血干细胞/祖细胞(hspc)衍生集落的数量。[0414]表14：(实验a2)hpsc动员，随后体内进行2小时的rv转导：骨髓(bm)；cfu：集落形成单位，m：单核细胞/巨噬细胞，g：粒细胞，gm：粒细胞/巨噬细胞，gemm：粒细胞/红细胞/巨噬细胞/巨核细胞。1+2+3：来自动员但未转导的阴性对照的汇集的骨髓，4到9：来自动员且rnv转导的小鼠个体的骨髓，10：来自未动员且未转导对照的骨髓：[0415]表14显示了在methocult gfm3434(stem cell technologies)中，在12孔板中每孔培养3×104个骨髓(bm)细胞5天后获得的gfp+造血干细胞/祖细胞(hspc)衍生集落的数量。[0416]表15：(实验a3)hpsc动员，随后体内进行2天的rnv转导；cfu：集落形成单位，m：单核细胞/巨噬细胞，g：粒细胞，gm：粒细胞/巨噬细胞，gemm：粒细胞/红细胞/巨噬细胞/巨核细胞。1+2+3：来自动员但未转导的阴性对照的汇集的外周血，4到9：来自动员且rnv转导的小鼠个体的外周血(注：#5在rnv注射后死亡并从分析中移除)，10：来自未动员且未转导的对照的外周血：[0417]表15显示了在methocult gfm3434(stem cell technologies)中，在12孔板中每孔培养4×104个外周血(pb)细胞7天后获得的gfp+造血干/祖细胞(hspc)衍生集落的数量。[0418]表16：(实验a3)hpsc动员，随后在体内进行2天的rnv转导：脾脏(s)；cfu：集落形成单位，m：单核细胞/巨噬细胞，g：粒细胞，gm：粒细胞/巨噬细胞，gemm：粒细胞/红细胞/巨噬细胞/巨核细胞。1+2+3：来自动员但未转导的阴性对照的汇集的脾细胞，4到9：来自动员且rnv转导的小鼠个体的脾细胞(注：#5在r注射后死亡并从分析中移除；#8没有形成集落)，10：来自未动员且未转导的对照的脾细胞(也未观察到集落)：[0419]表16显示了在methocult gfm3434(stem cell technologies)中，在12孔板中每孔培养2×105个脾脏(s)细胞7天后获得的gfp+造血干/祖细胞(hspc)衍生集落的数量。[0420]表17：(实验a3)hpsc动员，随后在体内进行2天的rnv转导：骨髓(bm)；cfu：集落形成单位，m：单核细胞/巨噬细胞，g：粒细胞，gm：粒细胞/巨噬细胞，gemm：粒细胞/红细胞/巨噬细胞/巨核细胞。1+2+3：来自动员但未转导的阴性对照的汇集的骨髓，4到9：来自动员且rnv转导的小鼠个体的骨髓(注：#5在rnv注射后死亡并从分析中移除)，10：来自未动员且未转导的对照的骨髓。[0421]表17显示了在methocult gfm3434(stem cell technologies)中，在12孔板中每孔培养3×104个骨髓(bm)细胞7天后获得的gfp+造血干细胞/祖细胞(hspc)衍生集落的数量。[0422]这些实验(a2和a3)表明，体内(iv)递送100-200μl中约2e7 tu的rnv可以产生高达约7％的hspc衍生的被转导的cfu。[0423]进行了另一个实验(实验b1)分析cd34+细胞的转导。使用了两组cd34+细胞：第1组-cd34+，无rv(24孔板中的1个孔)；第2组-cd34+，rv(24孔板中的2个孔)。将细胞解冻，在无血清sfemii+cc100细胞因子混合物(stemcell)中培养和扩增。用100μl cd34+细胞(3×105)接种细胞(24孔板中的3个孔)，将100μl rnv-gfp病毒以2ml的总体积添加到第2组的孔中。[0424]将细胞收集在15ml管中并用pbs洗涤，重新接种到24孔板的新孔中。将细胞在bbmm_cc100细胞因子扩增因子中再培养2天，通过facs分析gfp阳性cd34+细胞的存在。此外，通过在甲基纤维素中培养cd34+细胞15天以查看hspc集落是否为gpf+来进行gfp+hspc的多系重建。[0425]表18：(实验b1)人cd34+hspc体外rnv转导2小时：转导对照研究；cfu：集落形成单位，m：单核细胞/巨噬细胞，g：粒细胞，gm：粒细胞/巨噬细胞，gemm：粒细胞/红细胞/巨噬细胞/巨核细胞(未转导：未转导的对照cd34+细胞；rv td 1和rv td 2：rv转导重复)：[0426]表18显示了在methocult classic(gf h4434,stemcell technologies)中，在每个35mm培养皿中培养5×102个人cd34+细胞15天后获得的gfp+造血干/祖细胞(hspc)衍生集落的数量。[0427]该实验(b1)表明，施用体内小鼠干细胞转导的rnv制剂也能够转导人cd34++hspc。[0428]上文已经阐述了许多实施方式来说明本公开。以下的权利要求进一步阐述申请人认为的他们的发明。