（a）过表达目的基因。选择目的基因构建过表达载体，将过表达载体导入细胞中，检测目的基因的表达情况，并观察表型、功能的变化。

（b）敲除（敲低）目的基因。使用 RNA 干扰（RNAi）、CRISPR/Cas9、T-DNA 插入等方法敲除（敲低）目的基因，同时观察表型和功能变化。

（c） 回复实验。过表达的同时敲除（敲低）目的基因，或者是在敲除（敲低）的基础上过表达目的基因，观察表型和功能是否回复。

图 过表达、敲除验证基因功能

图片来源 DOI：10.1186/s13059-018-1523-0

3. 相互作用的研究方法

（a）荧光素酶报告系统。可用于验证 miRNA 与靶基因的相互作用，也用于检测转录因子与靶启动子的结合。

（b）RNA pull-down。用于研究 RNA 与蛋白质相互作用。使用 RNA 探针分离与RNA 结合的蛋白质。

（c）RIP-PCR。也是验证 RNA 与蛋白质互作的方法。运用针对目标蛋白的抗体，把 RNA- 蛋白复合物沉淀下来，分离纯化蛋白结合的 RNA，并进行 qPCR 验证，找到与目标蛋白结合的 RNA。RNA pull-down 和 RIP-PCR 的结果可以相互印证。

图 RNA pull down（左）与 RIP-PCR（右）原理示意图

图片来源 DOI：10.1186/s13059-018-1523-0

（d）凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）。是检测蛋白质和核酸序列（DNA 或RNA）相互结合的技术。蛋白与 DNA（RNA）结合形成的复合物由于分子量大，在电泳过程中迁移较慢，出现不同位置的条带。

图 EMSA 实验结果图

图片来源 DOI： 10.1242/jcs.064089

目的基因从定性定量验证、到基因功能验证、再到基因调控机制探究，既是对基因的认识逐渐深入，也是一步步接近高分文章的过程，可千万别因为测序问题倒在了第一步的验证。

转录组测序结果无法用 qPCR 验证，多半是受到建库 PCR 偏好性的影响：比如两个 RNA 分子 A 和 B 表达量是 3:2，但 PCR 扩增时产生了偏好性，导致建库时 B 分子扩增出更多的片段，测序结果 B 表达量反而更高，如下图左图所示，原本表达量为 3:2，但测出来却成了 6：8，跑偏成这样，还可能验证出来吗？

图 绝对定量转录组原理

选择绝对定量转录组测序就没有这个烦恼了。它能 hold 住各种验证，与 qPCR 检测结果高度一致，低丰度基因也轻松通过验证。

因为绝对定量转录组测序给每一个片段分子发了一个身份证，我们看身份证就能确定它是样本原有的片段，还是 PCR 偏好产生的多余片段。这个身份证就是数字标签（Unique Identifier，UMI），样本片段带有的数字标签是唯一的，而同一个片段经过 PCR 扩增产生的片段所带的数字标签则相同，根据标签识别出 PCR 扩增产生的多余 RNA 分子并去掉，还原成原始的 RNA 组成比例，如上图右所示，就可以对表达量精确定量了。

不仅如此，绝对定量转录组还解决了测序平台带来的定量偏差和测序错误问题，戳这个视频就能了解其中所有的玄机。

（大流量预警，请速连 WiFi）

使用 UMI 的绝对定量转录组能有效降低 PCR 扩增循环次数的影响。比较同一个样本扩增 15 和 25 个循环建库后的测序结果，理论上由于是同一个样本建库测序，所以结果相关性越高越好。从结果可以看出绝对定量转录组的结果一致性明显高于普通转录组。

图 绝对定量转录组降低 PCR 扩增循环次数影响，结果一致性更高

使用 qPCR 验证绝对定量转录组测序结果，两者的结果高度一致，相关系数 R2 达到 0.985。

图 绝对定量转录组测序结果通过 qPCR 验证

解决了 PCR 偏好性问题，再也不怕样品量太少，100 ng RNA 可以建库，2,000 个细胞也可以建库，是珍贵样本的选择。

图 左：100 ng ~1,000 ng 建库结果高度一致，右：2,000 个细胞建库结果

低表达量的基因测不到的问题也迎刃而解，多扩增个几个循环就 OK 啦，对于检测互作转录组中的微量寄生菌真是非常好用。

图 植物内生菌的互作转录组测序，内生菌参考基因比对率 2.53%

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题图来源：站酷海洛

文章来源：康测科技

其他配图来源：康测科技

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