干货必读!超声法ChIP实验,5万多科研者的共同选择!

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干货必读!超声法ChIP实验,5万多科研者的共同选择!

2024-07-11 22:19| 来源: 网络整理| 查看: 265

染色质免疫沉淀(ChIP)

表观遗传学作为当前研究热点,染色质免疫沉淀(ChIP)又是表观遗传学最有力的研究工具之一。

ChIP能够检测并相对定量体内蛋白质-DNA特异性的相互作用,是很多老师在基金申请和课题设计的常用技术,但大家在操作的时候往往会遇到各种各样的问题,面对繁琐的步骤,分析起来也是无从下手。

但是如果大家能提前了解蛋白与DAN相互作用“潜规则”,定能让你的ChIP实验对你“百依百顺”。

今天和大家揭秘ChIP实验中很重要的步骤--染色质DNA断裂方法的选择:

超声or酶解?

超声断裂法

染色质DNA断裂最常用的方法是超声断裂法。Upstate(默克旗下子品牌)推出的第一个商品化的ChIP试剂盒就是用该方法进行的。

随着科学技术的不断进步和表观研究的深入,默克的ChIP试剂盒已经发展到第四代,提供适用于不同样本、不同实验的十几款ChIP试剂盒。

根据Google学术统计,截止2016年1月1日,全球累积超过50000篇文献使用Millipore ChIP抽提试剂盒进行ChIP实验。

全球数万名科研人员的共同选择,一定不会错!

有图有真相:

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注:Upstate, Millipore为表观遗传学和信号通路的领导品牌,目前是默克生命科学旗下的子品牌。

当然,作为表观遗传学领域的领航者,默克的科学家们总结了几十年的研究经验,结合科研者们的血泪换来的实验技巧,力求让超声断裂法的结果更完美。

超声小贴士 1、不建议重复已发表的剪切方案而不进行优化优化。当您的仪器不同于那些方案中所使用的仪器时,尤其如此。 2、目前有各种超声破碎仪器,水浴和基于探头的。在使用基于探头的超声破碎仪时,选择一个适用于您的样品体积的探头。 3、在任何情况下,剪切参数都应当根据您的样品体积、细胞密度和细胞类型而优化。 4、优化应当包括功率设置(超声时间 vs. 间隙时间/休息时间)以及获得长度为200 – 1000 bp的DNA片段所需的剪切循环数,每个优化实验只优化一种参数; 5 、注意时间和功率设置。过度破碎和太高功率设置会损害您用在免疫沉淀步骤中的表位。这将降低您的ChIP信号。 6、始终保持裂解液冰冷,并间断超声,而不是连续,因为超声处理产生热量,会使染色质变性。 7、在超声破碎过程中避免气泡。泡沫会导致蛋白质的表面变性,可能使染色质损失在气泡中。为了避免这种情况,一开始设为较低功率,再逐步提高。 8 、在优化条件时,每个超声破碎循环后通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段的长度。为了获得最佳的大小,您应当开展额外的纯化步骤,以便在电泳前纯化DNA。剪切不足所产生的大的不溶蛋白质:DNA:RNA复合物可能堵塞琼脂糖凝胶的孔,并延缓电泳过程。通过消化蛋白质、逆转交联、酚:氯仿提取和沉淀来纯化DNA。 9、探头端应浸没,但不触碰管壁。为了批量制备染色质,我们建议使用15 mL锥形管,其最小体积为0.6 mL(1.2mL更加一致),并使用钳子来确保探头靠近底部但不触碰管壁。在超声处理过程中,管子本身应置于可调整的平台上,浸没在冰浴中。

酶解法

另一种染色质DNA断裂的方法是酶解法(微球菌核酸酶处理方法)。

有人认为该方法被比超声法温和,能更好保留染色质完整性和蛋白的抗原表位。确实,如果研究对象是高丰度表达的蛋白,同时它与DNA结合紧密(如组蛋白),那么样本可不需交联,这时可以使用酶解法。返回搜狐,查看更多

酶解法的局限 酶解法也会存在一定的局限性,首先酶解法的操作后仍需要超声进行处理,另外如下几种情况不推荐: 1、酶解法对于交联固定后的DNA处理效果不如超声法高效,同时酶法在37°C孵育样品可能会导致蛋白表位的降解; 2、酶切获得的DNA片段相对较短,不适合ChIP-chip,ChIP-Seq实验; 3、酶法获得的DNA片段相对较短,对于后续样品的PCR扩增和检测带来更多的困难; 4、酶切消化主要发生在核小体之间,并不是随机消化,对于一些基因如P53并不适合,因为蛋白结合位点位于核小体间的DNA linker序列中; 5、超声对DNA的裂解是随机的,对于实验重复性高于酶法处理; 6、部分研究者显示酶切方法不如超声敏感,可能酶法对部分染色质DNA的消化不如超声方法对细胞的裂解更加彻底,因此获得的DNA的量会较超声低一些; 7、 对于表达丰度较低的或与DNA结合不紧密的蛋白,如当前研究最多的转录因子,调控因子等。往往需要用交联试剂将样本(细胞or组织)进行固定,稳定蛋白质和DNA的形态,这时最好选用超声法进行断裂。 8、转录因子要慎用。因为有的转录因子较大,DNA结合区域覆盖多个核小体,酶切法会将结合区打碎。

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