一、慢病毒载体

慢病毒属于逆转录病毒科（retroviruses），由RNA型病毒构成，其特点是利用病毒逆转录酶（RT），通过病毒整合酶（IN）的作用将其病毒遗传信息插入宿主基因组。慢病毒这个名字来源于感染和疾病发作之间的较长时间。与其他逆转录病毒相反，慢病毒也可以在非分裂细胞中复制。它们是包膜病毒，直径在80到120nm之间（图1）。慢病毒具有不同的宿主物种，包括灵长类动物，它们的基因组结构和进入受体等特征也不同。由于基因治疗中使用的大多数慢病毒载体都是基于人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)，因此以下描述以这种病毒为中心。

图1 突出其主要结构成分的慢病毒形态。

HIV-1是一种逆转录病毒，具有两个相同拷贝的单链阳性RNA分子。病毒粒子被来自宿主细胞的磷脂包膜包裹，病毒糖蛋白（gp41和gp120）对病毒进入细胞很重要。病毒基因组进一步受到由p24蛋白形成的衣壳的保护，并且病毒具有两个额外的结构蛋白p17和p7。所有这些结构蛋白对于病毒复制周期中的基本功能很重要。在病毒中发现的其他成分包括逆转录酶，介导病毒RNA基因组转化为病毒DNA；整合酶，介导前病毒DNA基因组整合到宿主细胞基因组中；以及在病毒成熟过程中负责加工gag和gag-pol多蛋白的病毒蛋白酶。

HIV-1具有约9kb大小的单链阳性RNA基因组，具有编码九种病毒蛋白质的三个主要开放阅读框（图2，表1）。每个病毒颗粒都有两个相同的基因组RNA正义拷贝，每个拷贝都编码病毒复制所需的全部信息。最近的研究表明，这两个拷贝都是成功完成所必需的。病毒基因组的边缘是长末端重复序列(LTR)，每个序列包含三个区域，即U3、R和U5，它们对于转录、逆转录和整合至关重要。

图2慢病毒基因组的组织结构和主要元件（基于HIV-1）。

RNA基因组长约9kb，具有三个主要编码片段，gag（组抗原）、pol（聚合酶）和env（包膜），两侧是两个长末端重复序列(LTR)。每个LTR分为三个区域，U3、R和U5，尽管完整的LTR序列仅在逆转录过程中产生并存在于前病毒DNA中。LTR是病毒基因组的功能元件，对于病毒转录和复制周期至关重要。gag基因编码结构蛋白：基质(MA)、衣壳(CA)、核衣壳(NC)和转框多肽(TF)。pol基因编码蛋白酶（PR）、逆转录酶（RT）和整合酶（IN）。第三个必需基因env编码包膜蛋白、表面蛋白(SU)和跨膜蛋白(TM)。这些元件对所有逆转录病毒都很常见；然而，慢病毒基因组更复杂并且有额外的元件。Tat和rev是病毒基因表达的重要调节因子，分别编码增强转录和诱导晚期基因表达的RNA结合蛋白。此外，慢病毒基因组包括四个辅助调节元件，vif、vpr、vpu和nef，它们对体内的复制和发病机制很重要。

表1 逆转录病毒的编码片段及其功能。

1、复制周期

HIV-1复制周期（图3）始于包膜糖蛋白gp120与宿主细胞的CD4受体（或共受体CXCR4或CCR5）的结合。在这种附着之后，病毒包膜与细胞膜融合，导致病毒核心进入细胞。在那里，病毒衣壳蛋白没有被包裹，释放出RNA基因组和病毒酶（RT、IN和PR）。仍在细胞质中的RNA分子被RT酶逆转录成双链前病毒DNA分子。这种新合成的DNA分子与蛋白质（病毒和细胞）形成复合物，形成预整合复合物(PIC)，然后穿梭到细胞核。前病毒DNA整合到细胞基因组中（由IN酶介导）并开始转录成病毒mRNAs（由细胞RNA聚合酶II）。在一些剪接事件之后（图4），病毒mRNAs被输出到细胞质，在那里产生病毒蛋白。病毒蛋白和两个全长RNA转录物在细胞膜附近组装，病毒颗粒通过出芽释放。病毒颗粒的成熟发生在细胞外。

图3慢病毒复制周期的主要阶段（基于HIV-1周期）。

病毒颗粒进入宿主细胞是由与细胞受体CD4结合的包膜gp120糖蛋白介导的(1)。这会导致TM(gp41)的构象改变，从而促进病毒与细胞膜的融合(2)。病毒核心进入细胞质，在那里发生病毒RNA的脱壳和释放(3)。下一步是将病毒RNA逆转录为前病毒DNA，由RT逆转录酶介导(4)。在此步骤之后，组装前整合复合物(PIC)，由RT、IN、Vpr、MA和前病毒DNA组成。该复合物通过肌动蛋白微丝转运并通过核孔复合物进入细胞核(5)。在细胞核内，前病毒DNA通过IN整合酶的作用整合到细胞基因组中(6)。整合后，前病毒DNA通常由RNA聚合酶II转录，病毒基因的转录由5'LTR的U3区域介导(7)。形成一个单一的病毒转录物，一些拷贝最终会被包装成新形成的病毒颗粒，但其他拷贝将作为病毒蛋白质翻译的模板。因此，在后一种情况下，单个转录物经过剪接以产生不同的病毒mRNAs片段，然后从细胞核中输出(8)。在细胞质中，病毒mRNAs被翻译成不同的病毒蛋白，这些病毒蛋白由前体肽形成，这些前体肽经过病毒和细胞蛋白酶的切割(9)。病毒颗粒的组装发生在细胞膜中，并以前体结构蛋白与未剪接病毒RNA中存在的包装信号之间的相互作用开始(10)。下一个阶段是病毒出芽和释放，其中病毒颗粒从细胞表面出现，被细胞膜的部分包被，这些细胞膜含有在内质网中产生的病毒糖蛋白(11,12)。最后，在细胞外，病毒颗粒通过将病毒多蛋白裂解为单个蛋白质并将结构蛋白重组为最终的病毒排列而成熟(13)。

图4慢病毒mRNA剪接转录本（基于HIV-1基因组）。

整合的前病毒DNA被转录成大约9kb大小的单个mRNA转录本。然后将该单个转录本拼接成不同的转录本，这些转录本可以分为三个主要簇：（i）编码Gag-Pol多蛋白的初级mRNA；(ii)由初级转录本剪接产生的中间mRNA（约4kb），编码多蛋白Env或辅助蛋白Vif、Vpr和Vpu；(iii)额外剪接事件产生的短转录本（约2kb）并产生编码Tat、Rev和Nef蛋白的mRNA。

2、从慢病毒到慢病毒载体

尽管慢病毒载体是以HIV-1为基础的，但在过去几年里，慢病毒载体一直被用作在基于基因治疗的临床前研究和临床试验中传递基因的有效并安全的系统。考虑到这种用途有几个优点，这些都是基因治疗载体的重要特征，例如它们介导的长期表达或转导非分裂细胞的可能性。表2总结了它们在基因治疗应用中的优点和缺点。

表2 用于基因传递的慢病毒载体的主要优点和缺点。

自从第一次在基因治疗中使用慢病毒载体以来，为了在不影响效率的情况下提高安全性，已经引入了一些改进。由于慢病毒具有很高的突变和重组率，即使是载体生产也可能是危险的，尤其是在可能产生具有复制能力的慢病毒(RCL)的情况下。为了克服RCL问题，为提高慢病毒载体安全生产而制定的策略之一是分离不同质粒中的必需慢病毒基因并删除一些辅助基因。这种策略是过去几年开发的4代慢病毒载体之间的主要区别（图5），尽管在不同代中可以发现许多其他特征和变化（表3）。慢病毒载体开发用于基因治疗应用的另一个重要进展是假分型工程，其中非慢病毒包膜蛋白是用于生产慢病毒载体的过程。例如，最流行的改变之一是用来自水疱性口炎病毒包膜糖蛋白G的病毒VSV-G蛋白替换天然Env糖蛋白。这种修饰增加了病毒稳定性，从而提高了生产和增加产生的病毒滴度。此外，这种蛋白质具有普遍存在的受体，可以靶向更广泛的细胞。

图5 基因治疗中使用的不同慢病毒载体及其从野生型HIV-1改造而来的修饰。

第一代慢病毒载体是使用三个编码病毒蛋白的质粒生产的。在这些载体中，只有转基因包含基本的顺式作用元件（LTR、Ψ、RRE），这些元件允许它们包装在产生的慢病毒颗粒中。在第二代慢病毒载体中，质粒数量保持不变，但为了提高其安全性，删除了辅助基因。在第三代中，tat基因被消除，病毒基因组被分成一个额外含有rev基因的质粒。这还包括删除3'LTR的U3区域，产生自灭活病毒。最后，开发了第四代慢病毒载体，以进一步降低所用质粒之间重组的风险。为此，片段gag和pol进行了密码子优化。在这第四代中，保留了前几代的所有修改。

表3 不同代慢病毒载体的主要特征

First Generation

第一代复制缺陷型慢病毒载体使用三种不同的质粒生产：(i)包装构建体，包含所有必需基因（env基因除外）和所有调节蛋白和辅助蛋白；(ii)env质粒编码病毒包膜糖蛋白；(iii)包含所需转基因和所有必需的顺式作用的转移载体元件（LTR，Ψ，RRE）。前两个质粒没有包装信号(Ψ)或任何LTR，以防止它们包含在产生的载体颗粒中。

Second Generation

尽管第一代三系统质粒提供了重要的进步，一些安全问题仍然很重要，但RCLs仍然可以生成。为了进一步提高安全性，在第二代慢病毒载体中，在保留质粒数量的同时，删除了辅助基因（vif、vpu、vpr、nef）。这种修改不会对载体滴度或传染性产生负面影响，但会大大降低产生RCLs的机会。

Third Generation

慢病毒载体的下一个进步是必需基因(tat)的消除和第四个质粒中rev基因的引入。用巨细胞病毒(CMV)启动子等强异源启动子取代5’LTR中的U3区，从而满足了对Tat蛋白的需求。新质粒的加入，分离rev基因，通过降低RCL生成的可能性，进一步提高了病毒载体生产的安全性。这些慢病毒载体还增加了额外的改进，删除了3'LTR中的部分U3区域，生成SIN（自失活）载体，从而降低了在整合过程中激活附近基因的风险。这些慢病毒载体只有9个野生型HIV-1基因中的3个，这显着提高了它们的安全性。用于生产的四种构建体是：(i)带有gag和pol基因的包装质粒；(ii)带有rev基因的质粒；(iii)带有env（或VSV-G或其他假型蛋白）的质粒；(iv)带有转基因的质粒（和强异源启动子）。

Fourth Generation

使用第三代慢病毒载体形成RCL的可能性大大降低，然而，理论上，转移质粒和包装质粒之间仍有可能发生同源重组。为了解决这个问题，对gag和pol基因进行了密码子优化，从而消除了质粒之间的同源性。第四代慢病毒载体显示出更高的生物安全性；然而，病毒滴度受到了负面影响。可能正因为如此，它并没有被广泛使用，而前几代慢病毒载体仍然被更普遍地应用，尤其是第三代，因为其具有重要的优势（表4）。

表4 第三代慢病毒载体的主要优缺点。

3、慢病毒载体的其他改进

在不同的世代中引入了慢病毒载体设计的其他几项改进，以提高效率，促进其生产，或者如前所述，提高其生物安全性（图6）。其中一项改进是引入了顺式作用多聚嘌呤束(cPPT)，以提高病毒载体在体外和体内的转导效率。另一种改进慢病毒载体表达的策略是引入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，它增加了未剪接的RNA分子的数量，导致靶细胞中转基因表达的增加。慢病毒载体介导的整合导致的一个重要问题是转基因表达抑制的可能性，例如，表观遗传事件。为了解决这个问题，在慢病毒载体中引入了染色质-绝缘子序列。绝缘体具有阻止增强子-启动子相互作用和/或作为抑制沉默效应的屏障的能力。慢病毒载体的进一步工程化还包括将蛋白质或抗体与包膜糖蛋白融合，以改变它们的趋向性并将载体重新靶向特定细胞。另一种常见的用于指导和指定转基因表达的策略是在转基因构建体中包含组织特异性启动子。该策略不会选择要转导的细胞，而是由于特定启动子的存在而将转基因的表达限制在某种细胞类型。将转基因的表达限制在特定细胞中在中枢神经系统的情况下特别有用，其中不同细胞类型的存在使特定的转导变得困难。

图6 相对于野生型HIV-1病毒对慢病毒载体进行的修饰，以提高其安全性，同时保持其高效和高效生产。

SIN载体设计

大多数慢病毒载体中包含的另一个特征是包含自失活的长末端重复序列(SIN-LTR)，其中3'LTR中的U3区域已被部分删除（图7）。这一特性降低了慢病毒载体与野生型病毒重组的风险，从而提高了其安全性。在野生型HIV-1中，U3区域充当病毒增强子/启动子，对于病毒复制至关重要，尤其是对于新病毒颗粒的5'和3'LTR的形成。然而，在重组慢病毒载体（复制缺陷）中，这个区域是可有可无的，因为包装的RNA表达是由5'LTR区域驱动的，而转基因表达是由各自的启动子驱动的。部分缺失的U3区域将在整合过程中转移到5'和3'LTR区域，因此形成的任何病毒颗粒后代都将含有两个失活的LTR，转基因表达将仅由内部启动子驱动。

图7 自失活慢病毒载体。

在野生型HIV-1病毒中，病毒RNA在位于LTRs的U3区域的增强子-启动子序列的控制下转录，这是产生新病毒颗粒和继续复制周期所必需的。在逆转录过程中3'LTR的U3区域被转置到5'LTR。在自失活载体中，3'LTR的U3区域被部分删除，以阻断其增强子-启动子功能。整合后，前病毒DNA将在两个LTR中包含部分缺失的U3区域，从而阻止复制循环的进一步继续。

非整合型慢病毒载体

在基因治疗的背景下，使用慢病毒载体的主要优势之一是它们能够将所需的转基因稳定地整合到靶细胞基因组中。然而，整合可能导致不良后果的发展，例如致癌基因的激活。事实上，对于某些应用，非整合载体的开发仍然是有效的，具有更好的安全性。为了实现这一目标，慢病毒载体被设计成包含对前病毒DNA整合过程至关重要区域的突变，即(i)5'LTR的U3区域，(ii)3'LTR的U5区域，(iii)整合酶蛋白本身。

慢病毒载体假分型

如前所述，将不同的糖蛋白包含在慢病毒载体的包膜中会改变并增加可转导的靶细胞的种类，从而改善它们的趋向性。就像之前提到的那样，假型是从不同的病毒中产生包含包膜蛋白的病毒载体（或病毒）的过程。来自不同病毒的几种糖蛋白已被用于假型慢病毒载体并进行了研究，这些载体具有不同的优势，例如提高其效率或降低其毒性（表5）。

表5 用于慢病毒载体假分型的常见病毒糖蛋白。

4、慢病毒载体生产

任何用于基因转移的传递系统，无论是非病毒的还是病毒的，都必须优先使用安全简单、技术复杂性低的方法来生产/构建，当然，这种方法可以大量生产系统。在慢病毒载体的情况下，安全问题是生产方法发展的主要驱动力，也是病毒基因组被分成不同构建体的主要原因。然而，这一重要进展带来了新的挑战，因为所有构建体必须在工厂细胞中结合在一起才能产生有效的慢病毒载体颗粒。为此，使用了两种转染方法：瞬时转染和稳定转染。在第一种方法中，所有质粒（3个或4个，取决于所使用哪代慢病毒系统）同时瞬时转染到包装细胞系中（图8）。可以使用几种转染剂，如磷酸钙、聚乙烯亚胺(PEI)或阳离子脂质。第二种方法涉及使用已经包含一个或多个病毒基因的稳定包装细胞系，从而减少要转染的质粒数量。这两种方法各有利弊，它们的选择主要取决于实验室条件、安全法规和所需的病毒滴度。

图8 用于生产不同载体世代的慢病毒载体的质粒。

根据世代的不同，可以通过将3个或4个质粒转染到生产细胞中来生产慢病毒载体。或者，可以在生产中使用表达一种或两种病毒基因的稳定细胞系，从而减少要转染的质粒数量。

慢病毒载体生产中需要考虑的其他重要问题包括病毒颗粒纯化和浓缩的方法、效价评估程序、生产细胞系的选择和生产规模（图9）。出于研究目的，慢病毒载体的生产已在人胚胎细胞肾293（HEK293）或HEK293T贴壁细胞中使用瞬时转染方法得到充分证实。然而，对于临床试验，所需载体的数量和质量要高得多。因此，使用贴壁和悬浮细胞培养物开发了大规模方法。该过程相当昂贵和复杂，在欧洲和美国只有少数站点能够大规模生产GMP慢病毒载体颗粒。

图9 慢病毒载体生产主要步骤概述。

几种方法可用于转染病毒质粒，包括由脂质体介导的递送。可以使用不同的技术从生产细胞中浓缩和纯化产生的病毒颗粒，其中最常见的是超速离心。最后，可以使用几种量化慢病毒载体滴度的方法，尽管p24的量化是最常见的。

浓缩和纯化方法在慢病毒载体的生产中都非常重要，并且与所需的生产规模（研究或临床试验）密切相关。尽管如此，最常用于浓缩的方法可能是在初始过滤后对培养基进行离心。该方法还可以与阴离子交换层析相结合进行额外的纯化步骤。然而，这些方法并不适合大规模生产和体内应用，因为它们往往不能摆脱培养基/过程的污染。因此，在大规模生产中，结合了几种方法来实现三个主要目标：（i）载体的初步纯化；(ii)中间纯化以去除特定杂质；(iii)最终精炼以去除微量污染物。

最后，生产慢病毒载体的最后一步，即病毒生产效价的评估，对于调整载体剂量和评估转导效率也是非常重要的。有多种方法可用于此目的，例如(i)测量一种载体成分的数量（通常使用病毒p24蛋白）；(ii)测量受感染细胞中前病毒DNA拷贝的数量；(iii)测量受感染细胞中的转基因或报告基因表达。

5、慢病毒载体在临床试验中的应用

欧洲、美国、中国已经批准了一种基于慢病毒载体递送的基因治疗产品。这是一种体外基因疗法，可提供CD19特异性CAR-T细胞，用于治疗急性淋巴细胞白血病。由于其重要优势，慢病毒载体在一些临床试验中得到成功使用，特别是在罕见病方面。最近，它们还被应用于基因治疗研究，以治疗更常见的遗传和获得性疾病，包括β-地中海贫血、帕金森病和癌症。表6和表7详细介绍了使用慢病毒载体进行基因治疗临床试验的两个示例。

表6 使用慢病毒载体作为治疗基因的传递系统的基因治疗临床试验的实施例1。

表7 使用慢病毒载体作为治疗基因传递系统的基因治疗临床试验的实施例2。

二、γ逆转录病毒载体

和慢病毒一样，γ逆转录病毒也属于逆转录病毒科（retroviruses）。然而，它们的基因组组织更简单，这使得其基因工程比慢病毒更容易（图10）。作为基因治疗的载体，它们或多或少与慢病毒具有相同的优点和缺点。然而，与之相反的是，γ逆转录病毒只感染分裂中的细胞，也许正因如此，目前，它们在基因治疗中的应用比慢病毒少。此外，就插入诱变的风险而言，慢病毒载体似乎比γ逆转录病毒更安全。γ逆转录病毒主要用于早期的基因治疗研究，直到前面提到的X连锁严重联合免疫缺陷(SCID)试验事件（表8）在一些试验对象中观察到插入肿瘤发生。

图10 基于小鼠白血病病毒(MLV)的γ逆转录病毒基因组的结构。

RNA分子长约8.3kb，具有三个逆转录病毒主要编码片段gag（组抗原）、pol（聚合酶）和env（包膜），两侧是两个长末端重复序列(LTR)。与慢病毒相反，γ逆转录病毒基因组没有额外的编码片段。gag基因编码结构蛋白：基质(MA)、衣壳(CA)、核衣壳(NC)和p12。pol基因编码蛋白酶(PR)、逆转录酶(RT)和整合酶(IN)。第三个必需基因env编码包膜蛋白、表面蛋白(SU)和跨膜蛋白(TM)。

表8 使用γ逆转录病毒载体作为治疗基因传递系统的基因治疗临床试验的例子。