使用 Lipofectamine 3000 试剂将质粒 DNA 转染到 MDA |
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完全生长培养基成分货号含有 GlutaMAX 添加剂的 Gibco DMEMA363520110% Gibco FBSA3160401 适当的培养技术和程序是确保转染成功的重要组成部分。传代培养（也称为传代）是指移除培养基并将培养物中的细胞转移到新鲜的生长培养基中，从而实现细胞增殖。 请参阅我们为本实验方案提供的产品列表 传代将细胞置于 T-75 培养瓶中维持培养。使用 Gibco TrypLE 解离试剂。每 3-4 天进行一次细胞传代，以确保细胞尚未衰老。应仅在解冻后第5代至第25代之间进行细胞转染。如果设计的是涉及转染的实验，请确保设置与细胞传代一致。在实验开始前1天铺板用于转染的细胞。接种用于转染的细胞转染前一天，对 T-75 培养瓶中汇合度达 80%-90% 的细胞进行解离处理。使用标准台盼蓝拒染法进行细胞计数。 ——重要说明：根据所用的计数方法，测定的细胞数量和浓度可能存在显著差异；因此，在整个实验过程中保持一致并使用单一方法非常重要。转染当天，细胞培养物中的细胞活力必须 >90%，且汇合度达到 70%。 ——重要说明：即使细胞未达到适当的汇合度，也勿等到第二天再进行转染，否则会显著影响转染效率。对于24孔板的单个孔，加入 500 μL 生长培养基，从中接种 1.5 × 105 个细胞。转染方案成分货号Invitrogen Lipofectamine 3000 转染试剂L3000008Gibco Opti-MEM I 减血清培养基31985062Thermo Scientific Nunc 经细胞培养处理的多孔细胞培养板，24孔142475在转染当天（即细胞铺板后1天）执行以下步骤，这些步骤已针对使用 Invitrogen Lipofectamine 3000 转染试剂处理24孔板的单孔进行了优化： 步骤管复合成分每孔用量（24孔）1管1Opti-MEM I 培养基25 μLLipofectamine 3000 试剂2 μL2管2Opti-MEM I 培养基25 μLDNA 量（DNA 浓度应为 0.5–5 μg/μL）250 ngP3000™ 试剂0.5 μL3将管2溶液加入管1中，混匀4将步骤3所得混合物在室温下孵育 10-15 min5向细胞中加入 50 μL 步骤4所得复合物；轻轻涡旋平板，确保复合物均匀分布至整个孔中转染效率分析在转染 GFP 报告基因构建体后 48 h，通过显微镜和流式细胞仪评价细胞。为了评估转染效率，首先通过荧光显微镜观察细胞，以定性评估蛋白表达、形态和活力。然后，通过吸出培养基并替换为 250 μL 由 TrypLE 试剂与 1X DPBS (7:3) 组成的混合物，制备用于流式细胞分析的细胞。将细胞置于 37℃ 下孵育 10 min，然后使用移液器上下吹吸，确保以单细胞状态进行流式细胞分析。 小贴士和技巧转染时降低培养基中的血清含量（至 |
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