五步学会质粒构建原理 |
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1 质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切,一般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个,尽量使载体的末端具有特异性,防止自连。 补水至50ul,37°C孵育3~4小时,每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。酶切后载体通过切胶回收线性化载体。 双酶切1和2,在设置酶切体系时要考虑酶切温度以及Activity in NEBbuffer的问题,可在NEB公司主页的Double Digest Finder里面进行查询。 2 根据目的序列构建引物后,如果目的基因片段只有几十kb的话,可以选择退火方式使插入片段成为互补序列。 (1)引物设计方法:举个栗子,比如选择的限制性内切酶为BglII与HindIII,则根据酶切位点序列在引物的两端加粘性末端碱基序列。 引物合成形式:5’-GATCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCGA-5’ (2)在PCR仪中按照以下touch down程序运行95°C, 5 min; 95–85°C at −2°C /s; 85–25°C at −0.1°C /s; hold at 4°C。 3 线性化质粒载体与退火产物进行T4 DNA酶连接。 T4 DNA酶连接一般选择16℃过夜。 注:连接可以选择公式计算,一般按照最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:2,即最适插入片段使用量为0.06 pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得: 最适克隆载体使用量= [0.02×克隆载体碱基对数]ng (0.03 pmol) 最适插入片段使用量= [0.04×插入片段碱基对数]ng (0.06 pmol) 4 转化 将连接产物转化到受体菌中(一般为DH5a),涂板,培养过夜。注意质粒的抗性,选择对应的平板。 5 挑取单克隆,并鉴定 挑去平板上的单克隆培养,可以通过PCR或者酶切初步鉴定阳性克隆,对初步 鉴定出来的阳性克隆进行测序。 “医学方”始终致力于服务“医学人”,将最前沿、最有价值的临床、科研原创文章推送给各位临床医师、科研人员 返回搜狐,查看更多 |
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