第一次离心后出现黑色物体，后面连续做了两次，都有，不知道是哪个环节出现了问题，严格的无菌操作

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PTWIN1做表达载体表达蛋白的问题

我的表达载体是pTwin1，目的片段和载体均用BamHI 和NruI双酶切，连接，转化入T克隆菌，菌液验证，测序，测序正确；从该菌中提取重组质粒，转化表达菌BL21，菌液验证，然后1：100接种摇菌至OD600为0.6左右，加入IPTG 0.5mM，37度诱导，分别1小时，2小时，3小时，4小时，过夜取样，跑SDS-PAGE，看是否有目的条带。 pTwin1带有两个标签，但我用酶已经切掉了一个，所以他自身只带有一个大约24KD的标签，加上我的目的片段一3KD，大小应该为27KD左右；目的片段二25KD，大小应该为49KD。 我想问 ：我的目的蛋白测序正确但好像没表达，怎么回事呢？我已经做了2个月了，很急，请大家帮忙看看，谢谢了。  目的片段一：1为PTWIN1未诱导，2为PTWIN1诱导，3为目的片段未诱导，4-8分别是1h目的片段取诱导样，2h目的片段取诱导样，3h目的片段取诱导样，4h目的片段取诱导样，目的片段过夜诱导取样。MARKER是（最上面那根不算，由上到下116,66.2,45,35,25,18.4,14.14）该目的蛋白应在27KD处表达，但仔细看好像没有表达。

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构建的原核表达载体不表达我的目的蛋白

换了不同浓度的IPTG，用不同温度，不同诱导时间都做了，但都没有我的蛋白，菌落PCR，双酶切，测序都是对的，为什么不表达呢？

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