期刊：Bioactive Materials (IF=16.874)

技术：3D培养；单细胞转录组测序

导读

人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的肾脏类器官从基础疾病建模到个性化医疗具有广泛的应用前景。然而，改进控制肾脏类器官形成的生物物理和生化参数仍然是有必要的。本文使用单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 比较 SAPH 内成熟的类器官与生长的类器官在 Matrigel 内或气液界面处的差异。总共分析了 13,179 个细胞，揭示了 14 个不同的簇。类器官成分分析显示，Transwell 衍生的肾细胞类型比例更大，而 SAPH 衍生的类器官富含基质相关细胞群。值得注意的是，较高 G' SAPH 内的分化产生了具有更成熟基因表达谱的足细胞。此外，3D 微环境中的成熟显着减少了杂细胞类型的衍生，这是当前肾脏类器官的一个限制。这项工作证明了具有确定刚度的基于合成肽的水凝胶的效用，使肾脏类器官具有多种类型的微环境。

主要内容

1. Alpha4和Alpha5 SAPHs的力学特征

为了研究不同机械强度的SAPHs中肾脏类器官的分化，我们使用了两种肽水凝胶；Alpha4（软）和Alpha5（硬）。对两种SAPHs的透射电镜分析证实了含有富β-sheet纳米纤维的ecm样水凝胶微结构（图1A）。样品暴露于基础分化培养基中，该培养基在与肾脏类器官分化方案中的培养基变化相对应的时间点被替换（图1B）。在第0天，Alpha4的G‘为1050Pa，而Alpha5的G’显著升高，在4310Pa，因此证实了Alpha5与Alpha4相比是一种更硬的水凝胶。有趣的是，当暴露于基础培养基+肾脏类器官时，Alpha4的G‘在15天的过程中增加到71393Pa（图1C），而Alpha5的G’增加到16533Pa（图1D）。

2. SAPHs支持hipsc来源的肾脏类器官的生长和分化

采用 Takasato protocol在SAPHs中生成肾脏类器官（图2A）。首先，通过补充WNT信号激活因子CHIR99021，hiPSCs分化为单层，导致多能性标记OCT4的丢失和原始条纹的诱导。在第3天，Brachyury (T)的表达证实了这一点（图2B）。每个支持基质总共评估了18个类器官（每个条件下有6个类器官，3个独立实验）。随后的定量结果显示，两种SAPH条件下产生的类器官都具有高度的活力，随着基质刚度的增加，细胞活力略有下降（基质凝胶：92.47%，Alpha4：88.21%，Alpha5：84.25%）（图2C）。类器官含有WT1+足细胞，导致LTL++近端小管，并由层粘连蛋白基底膜支撑。此外，LTL+近端小管细胞靠近+远端小管。管状上皮内腔区域为ZO-1+，标志着这些结构的上皮紧密连接。肾类器官内的肾元结构由MEIS1/2/3+ve间质细胞支持。到第24天，H&E染色显示整个SAPH衍生的类器官呈分散的管状形态（图2D）。对于近端小管，以LTL+-1+紧密连接标记管腔，能够摄取荧光标记的葡聚糖（10000MW）（图2 E）。

3. Alpha4、Alpha5、Transwell和Matrigel整合数据集的scRNA-seq突出了肾脏类器官中肾细胞类型的多样性

为了进一步描述水凝胶中产生的细胞类型，我们检测了单细胞水平上的转录景观。分化第24天，用机械和酶法将包裹在Alpha4、Alpha5和基质凝胶中的类器官生成单细胞溶液。然后使用10x平台进行单细胞转录组学研究。此外，使用Harmony对Alpha4、Alpha5和基质衍生的类器官进行整合分析，基质分化的类器官比较三维基质生成的细胞类型和在气液界面生长的细胞类型。过滤去除应激细胞后，共保留13179个细胞（Alpha4 3,946；阿尔法5 3,350；基质凝胶1764；Transwell4119）用于分析。剔除线粒体基因和转录本数量大于25%的细胞。然后对合并的集成数据集进行无监督聚类，然后对聚类进行注释，显示14种不同的细胞类型，并使用统一流形近似和投影（UMAP）进行可视化（图3A）。使用集成的数据集，使在每种条件下具有相似基因表达谱的细胞类型适当地聚集在一起。这随后促进了簇内细胞类型的比较和识别具有独特基因表达特征的簇。通过将每个聚类的差异表达基因（DEGs）与文献中已知细胞类型的标记基因进行比较，并与GUDMAP（https://www.gudmap.org/）中的数据集进行比较，来确定每个聚类的细胞特性。每个群体中都有一个代表性标记基因的小提琴图（图3B）。每个簇还显示了5个最显著的DEG的热图（图3C）。采用层次聚类分析来研究生成的细胞类型之间的相似性（图3D）。

4. scRNA-seq揭示了在不同的细胞外生长环境中分化的肾脏类器官内的细胞异质性

一旦验证了不同条件下肾细胞类型的适当分化，接下来的目标是比较两种合成肽水凝胶中产生的细胞群与基质凝胶或Transwell插入物中形成的细胞群。通过类器官特性将整合的UMAP分离，并随后对每个簇的组成进行分析，发现类器官生长的细胞外环境对细胞群有显著影响（图4A和B）。然后将包含同一谱系的细胞类型的簇进行分组，并检查每个类器官的细胞类型组成（图4C）。通过UMAP可视化了高度富集的脱靶神经元基因的例子（图4D）。进一步比较细胞类型组成的百分比显示，与Alpha4相比，Alpha5衍生的类器官的肾元形成增加（图4C）。这反映在免疫荧光显示的LTL+-LTL+近端小管的相对丰度上（图4E）。transwell衍生的类器官透微镜缺乏与成熟足细胞相关的结构成分。相比之下，在支持基质中分化的类器官具有具有更成熟的结构特征的足细胞，包括初级和次级足突样结构（图4F）。肾元祖细胞簇缺乏转源性细胞，主要由Alpha5内产生的细胞类型组成。Alpha4和Alpha5显示PITX2和SHISA2的表达增加（图4G）。这些基因在肾元祖细胞诱导和自我更新中具有调节作用。近端前体簇在不同条件下表现出相似的基因表达谱，选择性基因持续存在到足细胞/肾小管上皮簇中（图4H）。跨孔来源的细胞组成了大多数足细胞/肾小管上皮簇，并显示了丰富的肾元指定基因LHX1和LYPD1（图4I）。每种情况下，未成熟足细胞标记物FOXC2、PAX8和WT1的表达都相似（图4J）。

参考文献：

Niall J Treacy , Shane Clerkin, Jessica L Davis, et al.Growth and differentiation of human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived kidney organoids using fully synthetic peptide hydrogels[J].Bioact Mater. 2022 Aug 19;21:142-156.PMID: 36093324 PMCID: PMC9420433 DOI: 10.1016/j.bioactmat.2022.08.003