CLIP的研究方法

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CLIP的研究方法

2023-07-12 12:47| 来源: 网络整理| 查看: 265

CLIP的英文全称为cross-linking immunoprecipitation,即交联免疫沉淀。

是一种利用紫外交联技术,将RNA与蛋白之间互作的弱作用力(如范德华力、氢键)转化为强作用力(共价键),并连用免疫沉淀,探究RNA与蛋白互作位点的分子生物学技术。基于CLIP技术可以在整个转录组水平上检测RNA结合蛋白的结合位点或RNA修饰(m6A)位点。

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CLIP的基本实验流程:

1紫外交联细胞,使RNA与蛋白之间形成共价结合。

2用特异性抗体调取特定蛋白与RNA复合物。

3用RNase消化掉没有结合蛋白的RNA,并用RNA连接酶连接3’端的接头。

4用蛋白酶K消化掉RNA结合蛋白,释放RNA。

5用PNK将5’磷酸集团转变为5’羟基,用RNA连接酶连接5’端接头。

6提取RNA,反转录并进行高通量测序。(蛋白与RNA交联处的核酸配对会发生突变)

clip大体流程

CLIP根据细胞处理方式和检测方式的不同,分为HITS-CLIP、PAR-CLIP、iCLIP。

HITS-CLIP也称为CHIP-seq,即通常所说的CLIP。将紫外线交联和免疫沉淀与高通量测序结合,以鉴定RNA结合蛋白的结合位点。该技术可用于检测特定RNA结合蛋白的RNA结合位点,或利用m6A抗体检测RNA修饰(m6A)位点,也可用于检测AGO2的靶标microRNA。

image PAR-CLIP

PAR-CLIP(photoactivatable ribonucleoside–enhanced cross-linkingand immunoprecipitation)该技术与普通CLIP的区别在于实验前细胞需加入核苷类似物如4-硫嘌呤(4-SU)或6-硫鸟苷(6-SG)(核苷类似物具有毒性),交联4-SU或 6-SG类似物分别导致胸苷到胞苷,鸟苷转化为腺苷转换。4-SU替代发生在每40个尿苷核苷中的大约1个中,并且T到C的转换频繁地发生在交联位点因此,PAR-CLIP可以高精度地识别结合位点。该技术主要用于检测含有微量RNA的核糖核蛋白的结合位点。如miRNP-AGO2/TNRC6

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iCLIP

iCLIP(individual nucleotide–resolution cross-linking andimmunoprecipitation)是一种单核苷酸分辨率的CLIP。该技术与普通CLIP的区别在于RNA结合序列5’端的接头是通过成环连接上去的。该方法相较于其他两种CLIP更为精确,可以精确到单个结合碱基。

iCLIP的流程 各种clip的区别


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