一、高压灭菌锅使用前要水加到水位线；

二、将需灭菌的培养基、蒸馏水或其它器皿放入灭菌锅内，关闭锅盖，检查排气阀、安全阀状态（上下排气阀打开安全阀关合然后加热，方便空气排出，上、下排气阀都同时处于开启状态待有水蒸汽从上、下阀溢出，此状态保持7、8分钟后，即排出空气后上排气阀关合，下排气阀调小，安全阀保持关合状态）；

三、打开电源，检查参数设置是否正确，然后按下“work”键，灭菌锅开始工作；自动派冷气，到105℃时，底部排气阀门自动关闭，然后压力开始上升；

四、压力升至0.15MPa（121℃）时，灭菌锅再次自动放气，然后开始记时，一般培养基灭菌20min，蒸馏水灭菌30min；

五、达到规定的灭菌时间后，关闭电源，打开放气阀缓慢放气；当压力指针降至0.00MPa时，放气阀无蒸汽排除时，方可开启锅盖。

六、注意事项

1、汽未放尽前，不得开启高压锅；

2、如果灭菌后的培养基在锅内不及时拿出，需在蒸汽放尽后将锅盖打开，切忌将培养基封闭在锅内过夜。

3、压力表指针在0.05MPa以上时，不能过快放汽，以防止压力急速下降，液体滚沸，从培养容器中溢出。

4、操作过程，请注意安全，小心烫伤。

在一个标准大气压下水的沸点是100摄氏度，压力越高,与之对应压力下的沸点越高，这里是高压蒸汽锅,说明压力肯定大于一个标准大气压(通常情况下的地表面的大气压强就认为是一个标准大气压)，也就是说高压蒸汽锅肯定要超过100摄氏度才能沸腾，才能产生蒸汽。至少要等到水煮沸，排出一分钟左右的蒸汽后再把安全阀关闭，这样可以使高压蒸汽锅里的压力迅速上升，原来沸腾的水因为压力的快速上升而停止沸腾，压力大，沸点高，水蒸汽就变成液体水，而放出大量的汽化潜热，就是高温高压的目的，从而达到杀菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：

一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；

二是湿热的穿透力比干热大；

三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2．26kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。

在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。要100度以上，也就是对应压力下的沸点后才能使水剧烈沸腾，将锅内空气更多的排除。

高温灭菌操作中常见错误的分析

高温灭菌是指用热能杀死微生物。其原理是高温使原生质中的蛋白质变性、使酶失活，致使微生物死亡。高温灭菌主要有高压蒸汽灭菌法、干热灭菌法和灼烧灭菌法几种。如果操作不当，即达不到预期的灭菌效果。现就常见错误分析如下。

1高压蒸汽灭菌

蒸汽灭菌属湿热灭菌，由于湿热灭菌有潜能存在，被灭菌物体的温度比蒸汽的低，蒸汽在其表面凝结成水，放出潜能，可迅速提高被灭菌物体的温度。又由于水和水蒸汽比空气的热容量大、导热快、穿透力强，所以，与干热灭菌相比，灭菌需要的温度低、时间短。由于高压蒸汽灭菌法水蒸汽的温度随其所受压力的增加而升高，因而灭菌用的高温蒸汽都是通过加压获得的。

手提式高压灭菌锅操作中常见的错误有：

（1）排气不彻底。在升压前应将锅内冷空气排净，因空气是热不良导体，若不排净，冷空气就会聚集井滞留在灭菌锅中消毒筒的中下部，围绕在待灭菌物的周围。在这种情况下，假若锅内仅排除一半空气，当压力表指针达到105Pa时，锅内实际温度仅能达到112℃，比要求的121℃低9℃之多，将导致灭菌不彻底，可能造成大面积染菌。（自动的高压灭菌锅上下排气阀都要打开然后加热排空气）

（2）排气软管没有按要求插入灭菌筒的下部，或排气软管断裂、缺失。灭菌锅内的冷空气是通过排气软管排出的，上述情况将造成灭菌筒外的蒸汽直接经排气阀排出锅外，灭菌锅内的空气排放受阻。

（3）消毒筒内物品堆积太紧、太满，阻碍蒸汽的流通和热交换，使容器内升温减慢，造成物体内部杀菌不完全。

（4）升温过快。灭菌的时间是以达到要求温度后的持续时间计算的，但温度的升降过程同样起到杀菌的作用，升降温度过快会通过影响总的积温而影响灭菌效果。另外，升温过快，特别是使用外源蒸汽的情况下，会造成被灭菌物体内部升温滞后于压力表指示温度。

（5）灭菌的物体体积（容量）过大。组织培养中或常规微生物实验中，高温蒸汽灭菌通常要在121℃（即蒸汽压力为1kg／c㎡或5磅／寸2，或0.105MPa）下保温15min。这一规定仅适用于试管、三角瓶中小于200ml容量的。若体积太大，特别是固体培养基，会造成灭菌不彻底，应适当延长灭菌时间。

（6）任意延长灭菌时间。规定的灭菌温度和时间是经过科学试验确定的，只要按照正确的灭菌程序是能达到灭菌目的的。但在实践中常有人为了“保证彻底灭菌”而任意延长灭菌时间。这样忽视了杀菌过程中温度对培养基成分的破坏作用，是得不偿失的。

（7）温度不稳定。灭菌过程中温度（压力）忽高忽低，特别是手提式电能灭菌锅，它没有控温装置，难于控温。操作者可配置调压变压器，通过调节电压控温。此外，还常遇到灭菌锅内加水太少（应加2～3L）；容器内装的溶液量过多（应少于2／3）；安全阀失灵等问题。

2干热灭菌

干热灭菌指在烘箱160℃温度下，维持2h，消除物体上的微生物的方法。常见错误有：

（1）将灭菌物品（如培养皿）堆摞放置，且堆得过满、过挤，阻碍空气流通和热量的传递、交换；

（2）升温时不打开箱顶通风孔，影响箱内冷空气及水汽的排除；

（3）高温（80℃以上）下开箱取物，热蒸汽喷出造成烧伤及突然降温，使玻璃器皿破裂；

（4）温度过高（180℃以上）造成包装纸、棉塞焦化，失去防菌或过滤作用；

（5）将不耐热的枪头、离心管、试管帽、滤器等塑料制品放入烤箱内灭菌，而致熔化。

3灼烧灭菌

即直接利用火焰将微生物灼烧致死。特点：简便、迅速、彻底。主要用于接种工具及器皿的灭菌。如接种杯、镊子、剪刀、玻棒、瓶口及其封口用的铝箔的灭菌常见的错误有：

（1）接种工具的灭菌范围不够，如长度不够，灼烧时没有旋转造成内外侧灭菌不匀；

（2）接种工具没有降至常温即用于接种；

（3）对玻璃器皿灼烧过度，使棉塞、封口膜焦化或熔化。

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