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作者：

吴丽华

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摘要：

裂褶多糖(Schizophyllan,SPG)是裂褶菌液体深层发酵得到的一种中性的胞外多糖.天然裂褶多糖具有抗肿瘤,保湿等多种生物活性,在医药,化妆品和保健品等领域有广泛的应用前景.但天然裂褶多糖分子量大,水溶性差,粘度高,影响其应用,在提高多糖产率的同时再研究对多糖的分子量进行调控具有重要的意义.本论文通过系统研究裂褶菌胞外多糖以及发酵体系中β-1,3-葡聚糖酶产生的条件及影响规律,研究发酵过程多糖得率,多糖分子量及发酵体系中酶的产生之间的相互关系,明确发酵调控因子,在保证多糖产率的前提下提高酶活,为发酵过程产物多糖分子量的调控提供理论依据.主要研究内容和结论如下:1.裂褶菌株的筛选及培养基的优化以SPG产量和β-1,3-葡聚糖内切酶和总酶活为考察指标,采用刚果红琼脂染色法和摇瓶培养,从四株裂褶菌GIM5.42,GIM5.43,GIM5.44,Sc1中筛选出多糖产量和酶活都相对较高的菌株GIM5.43,多糖产量和酶活分别为2.29 g/L与0.28 U/mL.因此选择该菌株进行后续研究,优化酵母浸膏,NH4Cl的补加策略,结果表明:当酵母浸膏含量为1.00 g/L时,得到小的松散菌丝体,多糖产量为5.31 g/L,但总酶活较低(0 U/mL);含量为7.00 g/L以上时得到絮状绒毛状菌体,多糖产量为0.50 g/L,总酶活为0.23 U/m L.为了保证多糖产率,采用分批补加策略,初始酵母浸膏浓度1.00 g/L,发酵第六天补加0.10 g/L酵母浸膏,多糖产量为4.16 g/L,比未优化提高了61.24%,总酶活为0.34 U/mL,提高了142.86%.当酵母浸膏含量较低(1.00 g/L),添加NH4Cl对酶活无促进作用,当其含量为3.00 g/L时,NH4Cl可提高总酶活达51.20%.2.添加生长因子和高聚物对发酵的影响分别向发酵体系中添加L-谷氨酸,维生素B1,柠檬酸等生长因子以及多糖等高聚物,研究这些环境因子对发酵过程及多糖和酶活的影响.结果表明,L-谷氨酸和维生素B1含量均为1.5 mg/L时,总酶活最高,分别为0.27 U/mL,0.24 U/m L,相比未添加生长因子提高了35.00%,33.33%,且多糖产量分别提高了7.52%,13.68%;当柠檬酸含量为100 mg/L时,多糖产量和总酶活有最大值,分别比未添加组提高了9.34%,15.79%;在培养基中添加SPG,凝胶多糖,羧甲基纤维素钠(CMC)和透明质酸,可使菌丝体更大的分散在培养基中,使得溶氧传质效率提高,从而使多糖产量增大,可分别提高45.74%,49.61%,37.03%,27.45%,总酶活分别提高了40.57%,37.14%,71.00%,72.58%;且添加SPG可得到小的辐射状菌丝体,添加凝胶多糖可得到小的松散菌丝体,添加CMC可得到羽毛絮状菌丝体.3.裂褶菌液体深层发酵技术研究在7 L发酵罐上进行裂褶菌的液体深层发酵研究.分别研究了溶氧,pH值等对发酵过程及多糖和酶产生的影响,得到较适的溶氧量和pH,在此基础上研究了三阶段发酵调控策略及分批补料策略.结果表明,采用三段发酵策略,即发酵前期(0-36 h),自然pH,溶氧量(DO)为40.00%,发酵中期(36-84 h),控制pH为3.80,DO为30.00%,发酵后期(84-108 h),控制pH为5.40,DO为45.00%时,SPG产量和葡聚糖酶活力分别达到了4.11 g/L,0.26 U/mL,比优化前分别提高了13.50%,107.98%;通过在48 h处单次补加15.00 g/L葡萄糖和间歇性每隔12 h三次补加5.00 g/L葡萄糖的方法,结果表明间歇性补加的方式更有利于多糖和酶的合成,分别比未补料组提高了44.20%,176.92%.4.发酵后期多糖分子量调控策略初探分别研究了添加外源性内切β-1,3-葡聚糖酶和利用发酵体系内源性β-1,3-葡聚糖酶对多糖分子量的影响.摇瓶培养菌体第7天时添加外源性的β-1,3-葡聚糖酶,酶可显著降解大分子多糖,但主要得到的酶解产物为分子量在7.96×103 Da的酶解多糖,表明该酶不适宜用于SPG分子量的调控.在发酵罐上培养4天的发酵液分离除去菌丝体后让其内源性的β-1,3-葡聚糖酶进行酶解,结果发现自身内源性酶对多糖具有一定的降解作用,多糖的分子量有一定程度的下降,表明利用裂褶菌发酵体系内源酶调控产物多糖分子量具有一定的可行性.

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关键词：

裂褶菌；裂褶多糖；β-1,3-葡聚糖酶；条件优化；酶解

学位级别：

硕士

DOI：

CNKI:CDMD:2.1017.855430