完整的Western实验过程比较长，没有结果也是常有的事，出现各种烦心结果也时有发生，最常见的一种就数显色后背景高了，背景高，目的蛋白颜色对比不明显，要么看不清，图片展示不理想，更别说进行数据分析了。显色背景高的原因有很多: 封闭问题，洗脱问题，一抗二抗问题等。其中最显著的就是封闭问题。

封闭液的作用和原理是怎么样的？Western 实验中，PVDF膜在甲醇活化后是带电的，因而在转膜时将蛋白吸附。封闭的目的是就将PVDF膜上无蛋白的部分空隙填满，以免孵抗体的时候，一抗二抗与之结合，产生非特异条带或者是背景杂乱。封闭这一步还是比较关键的，封闭不好容易造成高背景。封闭液有哪几种？怎么选择？最常用的封闭也就是脱脂奶粉和牛血清白蛋白（BSA），当然还有血清 ，鱼皮明胶， 聚乙烯吡咯烷酮，封闭液 这些封闭稀释液对实验有什么影响？为了让大家更方便的选择适合实验的封闭液，这里给大家介绍6种不同的封闭液，以及它们的优缺点。

1、脱脂奶粉最便宜而且最好买的封闭剂就属脱脂奶粉了。通常封闭液的浓度为 2.5-5% （w/v）。但值得注意的是，脱脂奶粉是许多种蛋白质的混合物，其中含有酪蛋白，是一种磷蛋白。如果你的目标蛋白是磷蛋白的话，千万不要选择脱脂奶粉，否则会有很多背景信号。即使你的目标蛋白不是磷蛋白，因为是蛋白质的混合物，所以也容易产生较高的背景信号。

2、牛血清白蛋白(BSA)牛血清白蛋白是从牛血清中提纯之后的一种球蛋白，是除了脱脂奶粉之外，非常常用的封闭剂。通常含有BSA的封闭液的浓度为2-5%（w/v）。但大家也可 以根据自己实验的需要来改变浓度，因为价格比较高，所以很多研究人员都是用尽可能低而有效的浓度。虽然BSA不是磷蛋白而且是单一蛋白，但是提纯过程中有可能含有IgG或其他血清蛋白等污染物，这些蛋白都可以和哺乳动物抗体产生交叉反应，会增加非特异性背景信号 。

3、血清血清如胎牛血清FBS含有大量的蛋白质，可以用于封闭。但与BSA一样，它含有免疫球蛋白和血清蛋白，这些蛋白会和哺乳动物抗体产生交叉反应，增加非特异性背景信号。而且血清价格更加昂贵，需要的浓度更高 (5-10 % w/v),因此在WB实验中血清一般用的较少，它更多地应用于免疫组化和免疫荧光实验中样本的封闭。

4、鱼皮明胶

明胶是胶原蛋白的产物，从冷水鱼皮肤中提取出来的明胶即使在低温情况下也不会凝固，通常使用浓度为0.1-5 % (w/v)。与BSA和血清不同，它不含任何血清蛋白，因此不会和哺乳动物抗体产生交叉反应，这大大降低了非特异性背景信号。但鱼胶含有内源生物素，因此不适用于生物素标记的抗体系统。

5、聚乙烯吡咯烷酮PVP 是传统封闭液的非蛋白质性质的替代品。虽然早在1993年就有文献发表，在封闭技术上却是很新的产品。PVP是一种水溶性多聚物，可以很快和硝酸纤维素和PVDF膜结合。通常使用的浓度在0.5-2%（w/v），而且通常会和其他封闭剂一起使用。PVP 在用于检测较小目标蛋白的时候非常有效。

6、封闭液商品化封闭液通常含有提纯过的蛋白，用这个封闭液的好处就是你可以确定里面不含有磷蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、生物素 等其他封闭液中难以避免的成分。当然，价格也就更贵。每个商品化封闭液都有自己的Protocol，基本照做就没问题，而且封闭时间很快。相信大家现在对各种封闭液都有了更全面的了解。总的来说，封闭液的选择基于三样事情：抗体、目标蛋白和检测系统。但是要想找到适合自己目标蛋白的封闭液，并不简单。除了排出一些很明显不合适的，剩下的就需要多花点时间尝试不同种类、不同浓度的封闭液，才能找到最适合的。

封闭的流程是怎么样的？

01、转膜结束前30 min，以TBST为缓冲体系 配置封闭液，并利用涡旋仪、摇床等仪器使封闭液充分溶解并混匀；

02、转膜结束后，在抗体孵育盒中加入适量封闭液，并用镊子夹住条带，将其完全浸泡在封闭液中，置于摇床上室温摇动孵育1-2 h，也可以4 ℃冰箱孵育过夜。

封闭有哪些常见的问题？

1. 条带上有黑色斑点奶粉未完全溶解。

出现黑点最常见的原因是奶粉没有完全溶解，建议利用涡旋仪、摇床等仪器使奶粉充分溶解并混匀，或溶解后离心取上清液使用。

2. 条带背景高封闭时间过短。

封闭的目的是使封闭液中的蛋白成分与膜表面的空白间隙结合，从而避免一抗的非特异性结合。封闭时间过短可能会导致一抗与空白间隙非特异性结合，背景变脏，可以增加封闭时间，或提高封闭液浓度。

3. 条带信号弱过度封闭。

条带信号弱，可以适当降低封闭液浓度，或者更换封闭液，封闭时间如果过长也可以考虑降低，但如果原本时间是1 h，不建议再缩短时间。但封闭过度很少见，条带信号弱可能要优先考虑其他条件，比如样品新鲜度、上样量、一抗二抗浓度等。

实验所需试剂

货号

试剂名称-(GBCBIO)

232100-100g 脱脂奶粉|Skim milk

0332-100g 牛血清白蛋白|BSA

9764-100g 明胶 | Gelatin | 9000-700-2

0507-25g 聚乙烯吡咯烷酮4万 | PVP 40,000 | 9003-39-8

G7205-500ml Western 快速封闭液 FastBlockTM Blocking Buffer

G7105 Western封闭液|Western Blocking Buffer

品牌优势

GBCBIO--自主品牌--物美价廉--服务优质

广州捷倍斯生物科技有限公司(GBCBIO Technologies)专注于生物试剂与诊断原料的研发、生产与销售，致力于提高国产生物试剂的竞争力。自主品牌----GBCBIO®牌核酸纯化试剂盒、ECL发光液、蛋白定量试剂盒与高端的表面活性剂等已为广大的科研与工业用户所使用，产品达到同类进口品牌的品质，具有物美价廉的特点！

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